Новости
13

янв

Кошка Матроска из Владивостока не будет символом Владивостока

Многие наверняка помнят историю произошедшую за несколько дней до

подробнее

22

дек

Промысловая обстановка хорошая заявил Андрей Горничных в режиме видеоконференции

Начальник Управления организации рыболовства Федерального агентства

подробнее

22

сен

Жители села Амга Примоского края до сих не получили никакой помощи после стихии

Как сообщает сайт «Новости Владивостока», север Приморского края, в

подробнее

17

сен

Дальневосточная рыба абсолютно безопасна, заявляют ученые

Зараженные воды, которые могли принести морские течения от «Фукусимы»

подробнее

17

сен

"Пиранья" поможет рыбоохране Бурятии

В ходе нового сезона охоты за браконьерами в Бурятии изъяты и

подробнее

Серебрение по морозову


2.5. Методы окраски жгутиков бактерий

Жгутики микроорганизмов — тончайшие образования (0,02 — 0,04 мкм), легко отрывающиеся от клетки при обработке. Это затрудняет их исследование. В основе методов окрашивания жгутиков лежит обработка их протравителями, в результате которой они увеличиваются в объеме.

Подготовка материала. Для подготовки культуры рекомендуется ежедневно несколько дней подряд делать пересевы на свежую питательную среду (в жидкую среду или в конденсационную воду свежей скошенной агаризованой среды). В день просмотра материал берут петлей и переносят в пробирку с 5 — 6 мл стерильной водопроводной воды, нагретой до 37 0С. Не рекомендуется размешивать бактериальную массу в воде петлей, она сама должна разойтись в ней в течение 30 — 60 мин. Прежде чем приступать к работе, необходимо проверить подвижность клеток в висячей капле. В случае отсутствия подвижности пробирку оставляют в термостате на 11/2 — 2 сут.

Для приготовления препаратов необходимы абсолютно чистые предметные стекла. Их кипятят в растворе бихромата калия в крепкой серной кислоте, затем дважды промывают в растворе едкого натра. После этого стекла промывают водой и хранят в банке с 96%-ным спиртом. Затем ту сторону стекла, на которую будет нанесен мазок, сильно нагревают и охлаждают.

2.5.1. Окраска жгутиков по методу Леффлера

Суспензию 12 — 16-часовой культуры бактерий наносят на предметное стекло и сушат при комнатной температуре. Допустимо зафиксировать мазок, быстро проведя его через пламя. Далее препарат обрабатывают протравителем 3 — 5 мин (способ 1) или 30-50 сек (способ 2), нагревая его до появления паров или в течение 15 — 20 мин при комнатной температуре, затем промывают сильной струей дистиллированной воды 30 с и высушивают на воздухе. Далее окрашивают препарат 3 — 4 мин карболовым фуксином Циля или раствором, содержащим 1 часть насыщенного спиртового раствора фуксина и 10 частей воды при легком нагревании до появления пара. Затем препарат промывают водой, высушивают и исследуют под микроскопом с иммерсией. Жгутики и клетки бактерий окрашиваются в розовый цвет.

Приготовление протравителя (готовят за 1-2 суток перед использованием):

способ 1: 12 г таннина растворяют при нагревании в 48 мл воды, добавляют 30 мл насыщенного водного раствора железного купороса (FeSO4) и 6 мл насыщенного раствора фуксина в 96%-ном спирте. Смесь готовят за несколько дней до использования, хранят в склянке с притертой пробкой в темном месте (в таких условиях может храниться несколько месяцев). Перед началом работы смесь фильтруют;

способ 2: смешивают 20%-ный водный раствор таннина, 1 мл насыщенного спиртового раствора основного фуксина, 5,5 мл насыщенного на холоду водного раствора сульфата закисного железа (соль Мора). Фильтруют перед использованием.

2.5.2. Метод серебрения жгутиков по Морозову

Готовят три реактива.

Состав первого: 1 мл ледяной уксусной кислоты, 2 мл формалина, 100 мл дистиллированной воды;

состав второго: 5 г таннина, 1 мл жидкой карболовой кислоты (фенола), 100 мл дистиллированной воды;

состав третьего: 5 г кристаллического нитрата серебра (AgNO3), 100 мл дистиллированной воды; отливают 20 мл в другой сосуд, а к оставшимся 80 мл раствора серебра по каплям приливают водный раствор аммиака (нашатырного спирта) до растворения образовавшегося осадка и появления легкой опалесценции. Если аммиака будет добавлено слишком много, то из оставшихся 20 мл раствора серебра следует добавить еще несколько капель до возникновения опалесценции.

Для окраски препарата полученный раствор серебра разводят дистиллированной водой в соотношении 1: 100.

Техника окраски:

  1. на 1 мин на препарат наливают первый реактив, сливают его, промывают препарат водой;

  2. наливают второй реактив, препарат подогревают на слабом пламени 1 мин до появления паров, тщательно промывают водой;

  3. при нагревании обрабатывают препарат 1 — 2 мин третьим реактивом до появления темно-коричневой окраски мазка, тщательно промывают водой, высушивают и микроскопируют с иммерсией.

Жгутики окрашиваются в буро-черный цвет.

studfiles.net

Серебрение по Морозову

Готовят 3 реактива: 1)1 мл ледяной ук­сусной кислоты, 2 мл имеющегося в продаже формалина, 100 мл дистиллированной воды; 2)5 г танина, 1 мл жидкой карбо­ловой кислоты, 100 мл дистиллированной воды; 3)5 г кристаллического нитрата серебра растворяют в 100 мл дистиллированной воды, отливают 20 мл в другой со­суд, к оставшимся 80 мл раствора по каплям добавляют рас­твор аммиака, пока не растворится образующийся осадок и не останется легкая опалесценция; если аммиака будет добавлено слишком много, то из отлитых в другой сосуд 20 мл раствора серебра надо добавлять по каплям до получения нужной слабой опалесценции. Для окраски препарата раствор серебра разво­дят дистиллированной водой 1:10.

Техника. Наливают на 1 мин первый реактив, сливают, промывают препарат водой, наливают второй реактив, подогревают на легком пламени до отхождения паров (1 мин), тщательно промывают водой, 1-2 мин при подогревании обраба­тывают препарат третьим реактивом до появления темно-корич­невой окраски мазка, тщательно промывают водой, высушивают. Рассматривают с иммерсионной системой.

Микроскопическая картина. Жгутики окрашиваются в буро-черный цвет.

Метод Грея

Растворы, составляющие протраву, смешивают за сутки до употребления. Растворы состоят из: 1) насыщен­ного водного раствора калийных квасцов K2SO4×12Н2О – 5 мл, 20% водного раствора танина – 2 мл и насыщенного водного раствора двухлористой ртути – 2 мл; 2) насыщенного спиртового раствора основного фуксина – 0,4 мл.

Техника. Протраву наливают на препарат на 8-10 мин, затем промы­вают его дистиллированной водой и окрашивают 5 мин карболо­вым фуксином Циля. Вновь промывают водой, сушат на воздухе и микроскопируют.

Микроскопическая картина. Жгутики окрашиваются в крас­ный цвет.

Окраска по Шенку

Протраву, состоящую из двух растворов, гото­вят за 7-10 дней до употребления. Первый раствор состоит из 30 мл насыщенного водного раствора танина и 10 мл 5% вод­ного раствора полуторахлористого железа, второй – из 1 мл анилина и 4 мл 95% спирта.

Техника. На препарат наносят 8 капель первого и 1 каплю второго раствора. После того как избыток протравы сливают, на п­репарат наносят краску (без промывания). Красить можно 1% сафранином в 50% спирте или метиленовым синим Леффлера. Хо­рошие результаты можно получить, применив для окраски смесь 30 мл метиленового синего Леффлера и 8 мл второго раствора протравы.

Микроскопическая картина. Жгутики приобретают синий цвет.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Page 2

Техника. Метод Петрука – модификация метода Грея. Вме­сто карболового фуксина применяют нитрат серебра, раствор которого готовят следующим образом: 1 г АgNОз растворяют в 2 мл дистиллированной воды, к нему по каплям добавляют 5% рас­твор аммиака до растворения образовавшегося осадка и появле­ния легкой опалесценции. Этот исходный раствор разбавляют в 10 раз дистиллированной водой и применяют для окраски. Пре­парат с нанесенным на него раствором нитрата серебра слегка подогревают над пламенем.

Микроскопическая картина. Жгутики окрашиваются в желто-коричневый цвет.

Окраска включений в бактериях

Окраска метахроматических зерен (волютина)

Волютин является запасным полифосфатом у некоторых видов бактерий, Его наличие и расположение в клетке может иметь диагностический характер, например, у коринебактерий дифтерии (тельца Бабеша-Эрнста).

Метод Нейссера

Способ 1.

Приготовление краски Нейссера: а) метиленового синего 0,1 г, 95% спирта 2 мл, ледяной уксусной кислоты 5 мл, дистиллированной воды 100 мл; б) раствор хризоидина, или везувина, или бисмаркабраун красителя 1 г, дистиллированной воды 300 мл. Краситель растворяют в кипящей воде и фильтруют через бу­магу.

Техника. Препараты выдерживают по 1 минуте в растворе метиленового синего и в растворе Люголя. Промывают водой. Докрашивают раствором хризоидина (или везувина, или бисмаркбраун) 1-3 мин. Промывают водой.

Микроскопическая картина. Тела бактерий окрашиваются в светло-желтый цвет, зерна Бабеша-Эрнста – в темно-синий.

Способ 2.

Приготовление растворов. Готовят ос­новные растворы:

Раствор 1:

- Метиленового синего – 0,1 г

- Этилового спирта 95° – 2 мл

- Ледяной уксусной кислоты – 5 мл

- Дистиллированной воды – 100 мл

Раствор 2:

- Кристаллвиолета – 1 г

- Этилового спирта 95° – 10 мл

- Дистиллированной воды – 300 мл

Для окраски смешивают две части раствора 1 с одной ча­стью раствора 2.

Техника окраски. На фиксированный мазок наливают смесь растворов 1 и 2, через минуту краску сливают и мазок обрабатывают раствором Люголя в течение минуты, затем про­мывают водой, докрашивают в течение 2-3 минут раствором хризоидина (1 г краски в 300 мл дистиллированной горячей воды), промывают водой и высушивают.

Микроскопическая картина. Тела бактерий окрашиваются в светло-желтый цвет, зерна волютина (Бабеша-Эрнста) – в темно-синий (рис.19).

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Page 3

Техника. К 2 мл этилового спирта добавляют 0,2 г то­луидинового синего, а затем 100 мл 5% раствора уксусной ки­слоты (5 мл ледяной уксусной кислоты + 95 мл воды). На фик­сированный мазок наливают краску и нагревают 1-2 минуты, до появления паров. Дают остыть, смывают водой и высушивают.

Микроскопическая картина: тела палочек – синего цвета, метахроматические зерна – красновато-фиолетовые.

Окраска по Мейеру

Техника. Одновременно из исследуемых бактерий готовят два одинаковых препарата и фиксируют жаром или в те­чение 5-15 мин в жидкости Карнуа. Красят оба мазка 10 мин метиленовым синим Леффлера и затем один из них помещают в 1% водный раствор серной кислоты, другой – в 4% водный раствор карбоната калия. Через 5 мин препараты сушат фильтровальной бумагой (не промывать). Препарат, обработанный кислотой, до­крашивают 0,25% раствором светлого зеленого (лихтгрюн) с 2-3 каплями крепкой уксусной кислоты или хризоидином.

Микроскопическая картина. Бактерии окрашиваются в зеленый или коричневый цвет, зерна волютина – в вишнево-красный. В препарате, обработанном щелочью, волю­тин обесцвечен – пустоты на фоне слабо окрашенных бактерий.

Флуорохромирование волю­тина корифосфином

Техника. 2 мл основного раствора корифосфина 1:1000 на дистиллированной воде, 6 мл уксусной кислоты, до 50 мл дистиллированной воды. Препарат фиксируют метиловым спиртом 8 с, промывают водой, высушивают. На 10 мин наливают рабочий раствор корифосфина, сливают, вновь промывают водой и высушивают на воздухе.

Микроскопическая картина. Бактерии желто-зеленые, зерна волютина оран­жево-красные.

Окраска по Раскиной

Техника. На препарат наливают краситель, со­стоящий из карболового фуксина Циля – 4 мл, насыщенного рас­твора метиленового синего – 4 мл, ледяной уксусной кислоты – 5 мл, 95% спирта – 95 мл, дистиллированной воды – до 200 мл. Препарат подогревают на пламени до сгорания спирта, а затем промывают водой и высушивают.

Микроскопическая картина. Бактерии окрашиваются в светло-красный цвет, зерна волютина – в черно-синий.

Окраска на грамофильную зернистость

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Page 4

Окраску применяют для выявления зернистой формы ту­беркулезных микобактерий (зерен Муха).

Техника. В смеси 10 мл насыщенного спиртового раствора метилового фиолетового и 100 мл 2% водного раствора карболовой кислоты препарат выдерживают сутки. Затем его 1-2 мин обрабатывают раствором Люголя, 1 мин – 5% раствором азотной кислоты и 10 с – 3% раствором хлористоводородной ки­слоты. После дифференцирования в смеси, состоящей из равных объемов спирта и ацетона, до прекращения отхождения краски промывают водой, докрашивают фуксином Пфейффера, вновь про­мывают водой и высушивают.

Микроскопическая картина. Микобактерии окрашиваются в фиолетовый цвет.

Метод Козлова

Метод применяют для выявления зернистой формы ту­беркулезных микобактерий.

Техника. Красят 45 мин в смеси: 1 г генциано­вого фиолетового, 6 г карболовой кислоты, 40 мл глицерина и 100 мл дистиллированной воды. Генциановый фиолетовый и кар­боловую кислоту предварительно растирают в ступке, после чего прибавляют глицерин и дистиллированную воду. Перед употреблением краску разводят 3 частями дистиллированной воды и фильтруют. После промывания препарата водой его 20 секунд обрабатывают раствором Люголя, промывают водой, 2-3 с окра­шивают 0,1% раствором сафранина, вновь промывают водой и су­шат.

Микроскопическая картина. Кислотоустойчивые бактерии окрашиваются в фиолетовый цвет.

Выявление клеточной стенки бактерий

При обычных методах окраски мазков клеточная стенка не окрашивается, поэтому применяют специальные методы с про­травами.

Метод Пешкова

Техника. Препарат фиксируют 15 мин в жидкости следующего состава: 90% спирта 60 мл, хлороформа 30 мл и уксусной эссенции 10 мл. Протравливают 2-5 мин в 10% водном растворе танина. За­тем препарат промывают водой, красят 30-60 с фуксином Пфейф­фера и, не промывая, сушат и микроскопируют.

Микроскопическая картина. Клеточная стенка окрашивается в розово-красный цвет.

Метод Гутштейна

Техника. Препарат, 1-2 ч фиксированный в жидкости Буэна, 2-3 мин подвергают действию протравы (5-10% водный раствор танина), ополаскивают водой и микроскопируют в капле 0,01% водного раствора кристаллического фиолетового.

Микроскопическая картина. Клеточная стенка приобретает фиолетовый цвет.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Page 5

Техника. Препарат, фиксированный жаром, обрабатывают 3-5 мин протравой, состоящей из 70 мл насыщенного водного раствора калийных квасцов и 30 мл 20% водного раствора танина. На мазок, промытый водой, наносят каплю карболового фуксина, закрывают покровным стеклом и микроскопируют, не удаляя краску.

Микроскопическая картина. Клеточная стенка окрашивается в красно-фиолетовый цвет.

Обнаружение нуклеоида бактерий

Окраска ядерных элементов. Метод Романовского

Техника. Препарат фиксируют метиловым спиртом, спирт-формолом, жидкостью Кар­нуа или смесью Никифорова. Окрашивают рабочим раствором кра­сителя (2 капли красителя Гимза на 1 мл дистиллированной воды) 10-20 мин. Промывают дистиллированной водой и после просушивания микроскопируют. Дистиллированная вода, применяемая для разведения красителя, должна иметь нейтральное значение рН, так как от этого в высокой степени зависят результаты окрашивания. Реакция дистиллированной воды, кроме обычно применяемых с этой целью способов, может быть проверена путем прибавления к ней кристаллика гематок­силина или нескольких капель его спиртового раствора. Вода пригодна, если в течение 2 мин не появляется розовая окра­ска; в противном случае она кислая и должна быть подщелочена 1 % раствором бикарбоната натрия.

Микроскопическая картина. При микроскопировании ядерные элементы имеют красно-фиолетовый цвет, цитоплазма – слабо-розовый.

Метод Пикарского

Техника. Препарат обрабатывают I N рас­твором НС1 7 мин при подогревании до 60°С. После про­мывания мазок окрашивают по Романовскому.

Микроскопическая картина. Ядерные эле­менты темно-красные, цитоплазма розовая.

Окраска риккетсий

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Page 6

Окраска по Романовскому-Гимза является одним из ос­новных методов при изучении морфологии риккетсий, хламидий, спиро­хет, простейших, а также при исследовании форменных элементов крови.

Техника. Краситель Романовского-Гимза состоит из азура, эозина и метиленового синего. Непосредственно перед упот­реблением к 10 мл дистиллированной воды нейтральной реакции прибавляют 10 капель краски и тотчас же наливают на препа­рат, предварительно фиксированный жидким фиксатором, на один час. Затем краску сливают, препарат промывают водой, высуши­вают на воздухе и микроскопируют. Окрашивание происходит бы­стрее (30-40 минут), если препарат с краской поместить в термостат при 37°С. К 10 мл дистиллированной воды нейтраль­ной или слабо щелочной реакции непосредственно перед окра­ской препарата прибавляют 10 капель краски и тот час же на­ливают на фиксированный препарат (или погружают препарат в стаканчик с краской). Через 1 час краску сливают, препарат промывают водой, высушивают на воздухе и исследуют. Если по­местить препарат с краской в термостат при 37º, то окрашива­ние происходит быстрее (30-40 минут).

Результаты окрашивания зависят от свойства воды, поэтому следует проверять ее реакцию.

Микроскопическая картина. Риккетсии окрашиваются в ро­зово-красный цвет, ядра эукариотических клеток – в красно-фиолетовый, а цитоплазма – в голубой.

Метод Здродовского

Техника. Препарат тонким слоем наносят на стекло, фик­сируют на пламени и окрашивают разведенным карболовым фуксином (10-15 капель фуксина на 10 мл дважды дистиллиро­ванной воды) в течение 5 минут; затем препарат слегка обес­цвечивают погружением на 1-3 секунды в слабую (0,01%) соля­ную кислоту, промывают водой и докрашивают в течение 30 секунд 1% раствором водного метиленового синего. Тонкий мазок фиксируют на пламени горелки. Окраску производят разведенным карболовым фуксином (10-15 капель фуксина на 10 мл дис­тиллированной воды) в течение 5 минут. Окрашенный препарат промывают водой, а затем обесцвечивают в растворе органиче­ской или минеральной кислоты (0,5% лимонная кислота, 0,01% соляная кислота) в течение 2-3 секунд. Затем препарат про­мывают водой и докрашивают 0,5% раствором метиленовой синьки в течение 0,5 минуты.

Микроскопическая картина. Риккетсии окрашиваются в ру­биново-красный цвет, в то время как клетки хозяина обес­цвечиваются кислотой и дополнительно окрашиваются в голубой (протоплазма) или синий (ядра) цвет (рис.20).

Окраска хламидий

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Page 7

Техника (см. выше).

Микроскопическая картина. На разных стадиях развития способность воспринимать окраску у хламидий меняется:

- “Элементарные тельца” (инфекционные частицы) окрашива­ются краской Гимза в пурпурный цвет.

- “Первоначальные тельца” (неинфекционные частицы) окра­шиваются по Гимза в синий цвет.

- Полностью сформировавшиеся зрелые внутриклеточные включения окрашиваются краской Гимза в пурпурный цвет (рис.21).

Метод Грама

Техника (см. выше).

Микроскопическая картина. Окраска по Граму дает вариа­бельные результаты. Поэтому не имеет диагностического значения.

Окраска водным разбавленным раствором Люголя

Придает внутриклеточным формам хламидий коричневый цвет из-за гликогеноподобной оболочки частиц.

Окраска микоплазм

Метод Романовского-Гимза

Техника (см. выше).

Микроскопическая картина. Исследование нативных препа­ратов не дает результата. Окрашивают препарат из куль­туры после агаровой фиксации: кусочек среды с колонией по­мещают на предметное стекло и накрывают покровным стеклом с каплей спиртового раствора метиленового синего и азура, за­тем препарат высушивают.

Окраска спирохет

Методы окраски спирохет делятся на две группы: методы позитивной окраски, когда окрашивается сама клетка, и методы негативной окраски, когда окрашивается фон препарата, а спирохета остается бесцветной.

Из методов позитивной окраски наиболее употребителен метод Романовского-Гимза.

Метод Романовского-Гимза

Техника. См. выше. Особенностью техники окрашивания препаратов спирохет является длительность окраски – в течение 12-15 часов.

Микроскопическая картина. Трепонемы окрашиваются в бледно-розовый, лептоспиры – розово-красный, а боррелии – сине-фиолетовый цвет.

Ускоренная модификация Шерешевского

Техника. 15-20 капель красителя Романовского-Гимза разводят в 10 мл 0,5-1% раствора глицерина в воде, разливают в 4-5 пробирок, каждую из которых последовательно нагревают на пламени горелки. Горячий раствор красителя наливают на препарат на 2 минуты, после чего краситель сливают и препарат заливают свежей порцией горячего раствора из следующей пробирки. Вся окраска занимает 8-10 минут.

Микроскопическая картина. См. метод Романовского-Гимза.

Окраска разведенным фуксином

Используется для окраски боррелий.

Техника.

Реактив: фуксин Циля разводят 1:4 или 1:5. Краситель наносят на фиксированный мазок на 1-2 минуты.

Микроскопическая картина. В мазках крови боррелии окрашиваются в розово- красный цвет, эритроциты – в ярко-красный.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Page 8

Техника. См. выше.

Микроскопическая картина. Спирохеты окрашиваются в буро-черный цвет (рис.22).

Для негативной окраски спирохет используют несколько методов.

Негативный метод Бурри

Техника. См. выше.

Микроскопическая картина. На темно-сером тушевом фоне – бесцветные клетки.

Негативная окраска колларголом

Этот метод отличается простотой, доступностью и хорошей эффективностью.

Техника. На фиксированный мазок наливают на 3 минуты 2% раствор колларгола. После этого препарат ставят в наклонное положение (водой не смывают) и подсушивают.

Микроскопическая картина. На золотисто-оранжевом фоне отчетливо контурируется бесцветная спирохета.

Негативный метод Бурри

Техника. См. выше.

Микроскопическая картина. На темно-сером тушевом фоне – бесцветные клетки.

Окраска простейших

Метод Романовского-Гимза

Техника. См. выше.

Микроскопическая картина. Клеточная цитоплазма окрашивается в голубой цвет, а ядра клеток и жгутики – в красно-фиолетовый цвет (рис.23).

Метод Райта

Техника.

Реактивы. Способ приготовления: 1% раствор щелочного метиленового синего на 0,5% растворе двууглекислого натрия наливают в сосуд таким образом, чтобы высота слоя жидкости не превышала 6 см, и нагревают при 100° С в течение часа. Затем жидкость охлаждают и фильтруют. Охлажденный фильтрат в тонком слое при искусственном освещении должен иметь пурпурно-красный оттенок. К 100 мл фильтрата добавляют 500 мл 0,1% водного раствора эозина. При смешивании обеих жидкостей образуется обильный осадок; последний отфильтровывают и высушивают. Полученный таким образом краситель растворяют в ступке в метиловом спирте в соотношении 0,1:60,0.

На сухой нефиксированный мазок наливают несколько капель красителя. Спустя 1 минуту прибавляют столько же капель дистиллированной воды. Через 2-3 минуты препарат промывают в воде около 0,5 минуты, пока он в тонком слое не приобретет розоватого оттенка.

Микроскопическая картина. Ядра простейших окрашиваются в вишнево-красный цвет, цитоплазма – в голубоватый, жгутики – в красный цвет.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Page 9

Техника.

Реактивы. 1) Жидкость Шаудина: делают смесь 1 объема 96° этилового спирта с 2 объемами насыщенного раствора сулемы; к этой смеси непосредственно перед употреблением приливают ледяную уксусную кислоту в количестве 3-5% к общему объему. Смесь употребляют слегка нагретой (до появления паров). 2)Спирт этиловый 70-96°. 3) Спирт-йод – 70° этиловый спирт, к которому добавлена настойка йода до красноватого цвета. 4) Железо-аммониевые квасцы, 2,5-4% водный раствор. 5) Раствор гематоксилина: 1 г кристаллического гематоксилина растворяют в 10 мл 96° этилового спирта и доливают до 100 мл дистиллированной водой: настаивают на свету при комнатной температуре 2-3 недели.

Жидкость Шаудина наносят на нефиксированный мазок на 2-5 минут. Затем мазок помещают в 70° этиловый спирт на 2 минуты, смесь этилового спирта с йодом на 2 минуты и снова в этиловый спирт на 2 минуты. Мазок промывают дистиллированной водой в течение 2 минут и помещают в раствор железо-аммониевых квасцов на сутки. Через сутки мазки быстро ополаскивают дистиллированной водой, дают стечь воде и переносят в раствор гематоксилина на сутки. После этого мазки промывают водопроводной водой в течение 5 минут и далее дифференцируют 2% раствором квасцов.

Дифференцирование является наиболее трудным моментом. Его цель – удаление излишка краски для выявления структуры простейших. Оно проводится под контролем микроскопа. С препарата осторожно удаляют осадок краски и наливают раствор квасцов. Дифференцирование прекращают, когда протоплазма отдаст излишек краски, и появятся четкие контуры клеток. После этого препарат промывают проточной водой и подсушивают.

Микроскопическая картина. На серо-лиловом фоне цитоплазмы клеток отчетливо видны черные хроматиновые элементы ядер.

Окраска йодом и йод-эозином

Используется для окраски нативных мазков амеб и их цист.

Техника. Для приготовления мазка используют раствор Люголя, приготовленный следующим образом: в 100 мл дистиллированной воды сначала растворяют 2 г йодистого калия, а затем 1 г кристаллического йода. Жидкость хранят в склянке темного стекла.

Йод-эозин (по Дональдсону): смешивают равные объемы насыщенного раствора кристаллического йода в 5% водном растворе йодистого калия и насыщенного водного раствора желтого (водорастворимого) эозина.

Микроскопическая картина. Цисты и вегетативные клетки приобретают четкие контуры коричневого оттенка.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Page 10

Используется для выявления амеб и их цист.

Техника. См. выше.

Микроскопическая картина. На темно-сером тушевом фоне видны бесцветные клетки и цисты (рис.24).

Микроскопическое исследование актиномицетов

Простые методы окраски (см. выше)

Техника. См. выше.

Микроскопическая картина. Клетки приобретают цвет примененного красителя (рис.25).

Метод Грама

Техника. См. выше.

Микроскопическая картина. Клетки окрашиваются грамположительно (в сине-фиолетовый цвет).

Микроскопическое исследование патогенных грибов

Исследуемый материал помещают на предметное стекло в каплю 10-20% едкой щелочи (или смеси спирта с глицерином), закрывают покровным стеклом и исследуют сразу после приго­товления и через 20 минут (рис.26).

Основные красители

Наиболее часто применяемые в микологической практике красители для контрастного окрашивания мицелия – метиленовый синий, метиловый фиолетовый, генциановый фиолетовый, раствор Люголя.

Метиленовый синий применяют в виде спиртовых, водных, щелочных растворов: 1) спиртовый раствор: к 100 мл 96%-ного спирта добавляют 3 г краски, взбалтывают, оставляют отсто­яться на несколько суток, фильтруют; перед употреблением разводят в 5-10 раз; раствор прочный; 2) водный раствор: к 100 мл воды добавляют 2 г краски, отстаивают 2 суток; перио­дически взбалтывают.

Окраска метиленовым синим

Техника. На зафиксированный мазок наносят водно-спиртовый раствор метиленового синего на 5-10 мин.

Микроскопическая картина. Клетки окрашиваются в синий цвет (рис.27)

Дифференциальное окрашивание мицелия

Техника. Готовят смесь Судана 3, хлопчатобумажного синего и йода в молочной кислоте (1:1:1).

Микроскопическая картина. В гифах жир окрашивается в ярко-оранжевый цвет, гликоген – в буро-красный, а прото­плазма – в синий.

Окрашивание амилоидной оболочки

Применяют для большин­ства сумчатых и несовершенных грибов.

Техника. Краси­тель – раствор Люголя. Несколько капель раствора добавляют к готовому препарату на предметное стекло. Время окрашивания от нескольких секунд до 1 часа.

Микроскопическая картина. Амилоидные оболочки окраши­ваются в синий цвет.

Окрашивание клеточной оболочки

Метод Пешкова

Применяют для дрожжей и низших грибов.

Техника. Препарат фикси­руют в жидкости Карнуа и опускают на 2-5 мин в 10%-ный рас­твор танина, тщательно промывают и красят фуксином Пфейффера в течение 30-60 секунд, не промывая микроскопируют.

Микроскопическая картина. Оболочки ок­рашиваются в синеватые цвета.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Page 11

Применяют для всех видов грибов.

Техника. Препарат фиксируют любым спо­собом, помещают в 0,5%-ный водный раствор генцианового фио­летового на 1,5-2 мин, промывают, помещают в 0,5%-ный водный раствор конго красного на 2-3 мин, промывают, подсушивают.

Микроскопическая картина. Оболочки окрашиваются в темно-синий или черный цвет

Окрашивание хитиновых веществ

Метод Висселинга

Техника. Препарат кипятят в концентрированной щелочи в течение часа, промывают, нейтрализуют серной кисло­той до получения нейтральной реакции. Затем добавляют две капли раствора йода в йодистом калии и несколько капель раз­веденной серной кислоты.

Микроскопическая картина. Хитин окрашивается в ярко-фиолето­вый цвет.

Определение хитина и хитозана в мицелии

Техника. Отфильтрованный мицелий помещают в аппарат Сосклета для удаления жира эфиром и, если надо, пигмента. Пигмент удаляют спирто-бензолом (1:4) затем отмывают до полного исчезновения спирто-бензола, заливают 4-5%-ным едким натром и кипятят в водяной бане 3-4 ч, после чего проверяют на белок биуретовой реакцией.

Для этого к 5-6 мл раствора добавляют такое же количество 10%-ного раствора щелочи, хорошо взбалтывают, после чего добавляют 2-3 капли 3%-ного раствора сернокислой меди и слабо нагревают; белок окрашивается в фиолетовый цвет.

Если реакция отрицательная, то мицелий отмывают от щелочи до нейтральной реакции и обра­батывают 50%-ным едким натром при 140°С в течение 1-2 ч. Проверяют наличие хитозана качественной реакцией со слабым раствором йода; хитозан окрашивается в фиолетовый цвет.

Да­лее препарат заливают 1-2%-ной уксусной кислотой, в которой хитозан растворяется. После окончательного растворения хито­зана, о чем судят по исчезновению фиолетовой окраски, оста­ется хитин, который окрашивается слабым раствором йода в ин­тенсивный коричневый цвет. Для количественного определения полученный материал заливают абсолютным спиртом на 2-3 ч, высушивают в вакууме при 40°С и гидролизуют концентрированной соляной кислотой. Затем определяют количество редуцирующих сахаров (методом Хагедорна-Йенсена).

Окрашивание ядерного аппарата

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Page 12

Техника. Препарат фиксируют жид­костью Карнуа в течение 10-30 мин, промывают 80%-ным спиртом и проводят через нисходящие концентрации спиртов. Реакция проявляется только в гидролизованном материале. Последова­тельность гидролиза: препарат помещают на 2-3 мин в 1 N pаствор соляной кислоты при комнатной температуре, затем на 5-6 мин в 1 N pаствор соляной кислоты, нагретой до 60°С, и снова в первый раствор на 1-2 мин, затем помещают в реактив Шиффа на 2-3 ч. Реактив Шиффа готовят следующим образом: 0,5 г основного фуксина растворяют в 90 мл кипящей дистиллирован­ной воды, охлаждают до 50°С, фильтруют и прибавляют 3 мл кон­центрированной соляной кислоты. Отдельно в 10 мл холодной воды растворяют 2 г безводного или 4 г кристаллического сульфата натрия. Полученный раствор сульфата приливают к раствору фуксина, охлажденному до 25°С.

Второй способ приготовления раствора Шиффа: 1 г основного фуксина для фуксинсернистой кислоты растворяют в 200 мл кипя­щей дистиллированной воды, охлаждают до 50°С, фильтруют и до­бавляют 20 мл 1 N cоляной кислоты, охлаждают до 25°С и до­бавляют 1 г метабисульфита натрия или калия. Реактив хранят на холоду в широкой склянке с притертой пробкой. Реактив считается пригодным, пока он сохраняет запах сернистого газа и цвет бледного чая (розовая окраска является цветом непри­годности).

Препарат промывают по 15-20 мин в трех порциях сернистых вод и затем в дистиллированной воде. Способ приготовления сернистых вод: 1) к 200 мл дистиллированной воды добавляют 4 мл концентрированной соляной кислоты; отдельно в 25 мл дис­тиллированной воды растворяют 4 г безводного или 8 г кри­сталлического сульфата натрия, приливают этот раствор к подкисленной воде, взбалтывают и дают отстояться или 2) 0,5 г метабисульфита натрия или кали, 5 мл 1н. соляной кислоты по­мещают в колбу и доводят объем раствора до 100 мл дистилли­рованной водой. Для получения более контрастных препаратов их докрашивают 0,1-0,25%-ным раствором, лучше слабо подкисленным, светло-зеленого или водного голубого (вассерблау). Препарат промывают водой, высушивают, проводят через ряд спиртов восходящей концентрации до абсолютного, ксилол и по­мещают в бальзам.

Микроскопическая картина. Ядерные элементы окрашиваются в красно-фиолетовый цвет, протоплазма при докрашивании приобретает зеленый оттенок. Лучше всего окрашиваются конидии несовер­шенных грибов.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Page 13

Техника. Препарат фиксируют любым способом, помещают на 5-12 ч в 1%-ный раствор сафранина, который готовят смешиванием 1%-ного раствора водорастворимого сафранина и воды (1:1); про­мывают в воде, затем в спирте, снова трехкратно в воде по 15 мин, затем помещают в 2%-ный водный раствор генцианового фиолетового на 30 мин, промывают водой и помещают в 1%-ный водный раствор оранжа на 1-3 мин, после чего промывают в гвоздичном масле.

Микроскопическая картина. Протоплазма окрашивается в розовый цвет, ахроматиновые элементы клетчатки – в фиолетовый, хроматино­вые структуры – в красный.

Окрашивание гематоксилином Делафильда

Техника. Препарат фикси­руют 35-50%-ным спиртом и помещают в краситель, для изготов­ления которого 1 г гематоксилина растворяют в 6 мл абсолют­ного спирта и этот раствор вливают по каплям в 100 мл насы­щенного водного раствора аммонийных квасцов и оставляют сто­ять в течение недели, затем прибавляют по 25 мл глицерина и метилового спирта и фильтруют через 4 ч. Время окрашивания 3-30 мин. Препарат промывают в нескольких сменах воды 5-30 мин. Для дифференциации структур клетки к воде или спирту добавляют соляную кислоту (1 капля на 100 мл воды); После чего промывают 70%-ным спиртом и водой.

Микроскопическая картина. Ядра окрашиваются в красный цвет, протоплазма в фиолетовый.

Окрашивание гематоксилином и эозином (или эритрозином)

Техника. Препарат окрашивают гематоксилином Делафильда и дифференци­руют подкисленным спиртом. Срезы объекта погружают в 1%-ный спиртовой раствор эозина (или эритрозина) на 1-2 мин, прово­дят через крепкие спирты, промывают как обычно.

Микроскопическая картина. Ядро и клет­чатка окрашиваются в пурпурный цвет, протоплазма – в розо­вый. Особенно хорошо окрашиваются ржавчинные грибы.

Окрашивание борным кармином

Применяется при изучении ядер, хромосом и т.д.

Техника. В 100 мл воды, нагретой до 50°С, рас­творяют 4 г буры, добавляют 3 г кармина, а потом доливают 100 мл 70%-ного спирта и фильтруют. Препарат фиксируют любым способом, промывают, обезвоживают до 50% проводкой через спирты, погружают в краситель на 1-3 дня, промывают 70%-ным спиртом, подкисленным 1-2 каплями соляной кислоты, 2-3 дня.

Микроскопическая картина. Ядра окрашиваются в яркий розовый цвет.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Page 14

Особенно хорошо окрашива­ются ядра в гифах несовершенных грибов.

Техника. Препарат фиксируют метиловым спиртом, смесью спирта с формалином или жидкостью Карнуа по следующей схеме: Фиксация жидкости Карнуа 10 мин; промывка в 96%-ном спирте; выдерживание в 70%-ном спирте 30 мин; промывка в дистиллированной воде; выдерживание в холод­ной соляной кислоте 6 мин; гидролиз 4-6 мин при 60°С; про­мывка в холодной 1 н. соляной кислоте и дистиллированной воде; выдерживание 15 мин в буферном растворе (фосфатный бу­фер, pH 6,9), затем 30-40 мин в растворе Гимза (исходный раствор и буфер (1:1) готовят непосредственно перед употреб­лением).

Приготовление раствора Гимза: 3,8 г азурэозина раство­ряют в 125 мл глицерина при 60°С, добавляют 395 мл метилового спирта и фильтруют.

Микроскопическая картина. Ядра окрашиваются в синий цвет. При мик­роскопировании препарат помещают в глицерин.

Микроскопия вирусов

Как известно, вирусы не могут быть рассмотрены в свето­вом микроскопе, поэтому в световом микроскопе изучают включения или ткани, пораженные вирусом. Изменения, проис­ходящие в тканях, изучают с помощью методов и приемов гис­тологического исследования, которые рассматриваются в соот­ветствующих руководствах.

Препараты для микроскопирования элементарных телец и включений готовят из мазков и отпечат­ков органов и тканей. Подготовленные мазки немедленно фиксируют. С этой целью применяют простые и сложные фиксаторы. Среди простых чаще других употребляют метиловый спирт, смесь Никифорова (спирта и эфира поровну), ацетон. Среди сложных фиксаторов нашли применение следую­щие: 1) смесь Дюбоска-Бразиля-Буэна: пикриновой кислоты 1 г, имеющегося в продаже (40%) формалина 60 мл, спирта (80%) 150 мл и ледяной уксусной кислоты 15 мл; 2) сулемовые смеси: а) Шаудина: насыщенного раствора сулемы 2 части и абсолютного спирта 1 часть; б) Ценкера: сулемы 5 г, бихро­мата калия 2,5 г, сульфата натрия 1 г, ледяной уксусной ки­слоты 5 мл, дистиллированной воды 100 мл. Уксусную кислоту добавляют в смесь перед употреблением; в) Хелли-Макси­мова: сулемы 5 г, бихромата калия 2,5 г, имеющегося в про­даже неразведенного формалина 10 мл, 2% раствора осмиевой кислоты 10 мл, дистиллированной воды 100 мл. Формалин и ос­миевую кислоту добавляют смесь перед употреблением.

Окраска препаратов

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Page 15

Техника. Нефиксированный препарат по­мещают в краситель, приготовленный следующим образом: насы­щают кармином 45%-ный (по объему) раствор уксусной кислоты при температуре кипения; после остывания, отстаивания и фильтрации на каждые 100 мл раствора прибавляют 1-2 капли 1-5%-ного раствора уксуснокислого железа. Время окрашивания – 1-24 ч.

Микроскопическая картина. Ядра окрашиваются в яркий розовый цвет.

Окрашивание пирокармином

Техника. Препарат фиксируют спиртом, промывают водой и помещают в краситель, приготовленный сле­дующим образом: 1 г кармина растворяют в 50 мл воды с 50 мл крепкого аммиака, добавляют 50 мл насыщенного раствора пик­риновой кислоты и оставляют в растворе красителя на 2-3 дня, затем фильтруют.

Микроскопическая картина. Ядра окрашиваются в яркий розовый цвет.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

studopedia.ru

Серебрение по Морозову

Окраска бледных трепонем серебрением по Морозову. Для

выполнения данной методики необходимы три реактива.

Реактив I: к 100 мл дистиллированной воды добавляют

2 мл 40% раствора формалина и 1 мл ледяной уксусной кислоты.

Реактив II: 100 мл дистиллированной воды объединяют с равным объемом жидкой карболовой кислоты и в них растворяют 5 г х. ч. танина.

Реактив III: в 100 мл дистиллированной воды растворяют 5 г кристаллического нитрата серебра. К приготовленному раствору по каплям добавляют насыщенный раствор аммиака до тех пор, пока образующийся при этом желтоватокоричневый переходящий в буроваточерный осадок не растворится, оставив легкую опалесценцию. Рабочее разведение реактива 1:10 дистиллированной водой.

Техника окраски. Тонкий препарат, приготовленный из тканевой жидкости, подлежащей исследованию, высушивают в термостате при температуре 37 °С. На сухой препарат наливают 5—10 капель реактива I, через 1 мин реактив I сливают и препарат промывают дистиллированной водой. На препарат наслаивают реактив II и подогревают на пламени горелки до появления паров, затем тщательно промывают препарат водой и наносят реактив III так, чтобы он покрыл всю поверхность препарата. Предметное стекло вновь подогревают в течение 2— 3 мин до тех пор, пока окраска мазка не станет темнокоричневой. После тщательного промывания дистиллированной водой препарат высушивают и исследуют в микроскопе, пользуясь иммерсионной системой.

Данный метод окрашивания дает импрегнацию серебром бледных трепонем, которые становятся темнокоричневого или почти черного цвета.

medicalinfos.ru

Метод Леффлера

Техника. За 1-2 суток до употребления готовят про­траву, состоящую из 1 мл насыщенного спиртового раствора ос­новного фуксина, 10 мл 20% водного раствора танина, 5,5 мл насыщенного на холоду водного раствора сульфата закисного аммиачного железа (соль Мора). Перед употреблением фильт­руют. Препарат, приготовленный на покровном стекле, фикси­руют и помещают на часовое стекло. Наливают протраву и 30-50 с подогревают до отхождения паров. Дав стеклу остыть, его промывают водой и, поместив на другое часовое стекло, красят фуксином Циля 2-3 мин при слабом подогревании. После тща­тельной промывки и высушивания препарат готов для микроско­пирования.

Микроскопическая картина. Жгутики окрашиваются в розово-красный цвет (рис.18).

Серебрение по Морозову

Готовят 3 реактива: 1)1 мл ледяной ук­сусной кислоты, 2 мл имеющегося в продаже формалина, 100 мл дистиллированной воды; 2)5 г танина, 1 мл жидкой карбо­ловой кислоты, 100 мл дистиллированной воды; 3)5 г кристаллического нитрата серебра растворяют в 100 мл дистиллированной воды, отливают 20 мл в другой со­суд, к оставшимся 80 мл раствора по каплям добавляют рас­твор аммиака, пока не растворится образующийся осадок и не останется легкая опалесценция; если аммиака будет добавлено слишком много, то из отлитых в другой сосуд 20 мл раствора серебра надо добавлять по каплям до получения нужной слабой опалесценции. Для окраски препарата раствор серебра разво­дят дистиллированной водой 1:10.

Техника. Наливают на 1 мин первый реактив, сливают, промывают препарат водой, наливают второй реактив, подогревают на легком пламени до отхождения паров (1 мин), тщательно промывают водой, 1-2 мин при подогревании обраба­тывают препарат третьим реактивом до появления темно-корич­невой окраски мазка, тщательно промывают водой, высушивают. Рассматривают с иммерсионной системой.

Микроскопическая картина. Жгутики окрашиваются в буро-черный цвет.

Метод Грея

Растворы, составляющие протраву, смешивают за сутки до употребления. Растворы состоят из: 1) насыщен­ного водного раствора калийных квасцов K2SO412Н2О – 5 мл, 20% водного раствора танина – 2 мл и насыщенного водного раствора двухлористой ртути – 2 мл; 2) насыщенного спиртового раствора основного фуксина – 0,4 мл.

Техника. Протраву наливают на препарат на 8-10 мин, затем промы­вают его дистиллированной водой и окрашивают 5 мин карболо­вым фуксином Циля. Вновь промывают водой, сушат на воздухе и микроскопируют.

Микроскопическая картина. Жгутики окрашиваются в крас­ный цвет.

Окраска по Шенку

Протраву, состоящую из двух растворов, гото­вят за 7-10 дней до употребления. Первый раствор состоит из 30 мл насыщенного водного раствора танина и 10 мл 5% вод­ного раствора полуторахлористого железа, второй – из 1 мл анилина и 4 мл 95% спирта.

Техника. На препарат наносят 8 капель первого и 1 каплю второго раствора. После того как избыток протравы сливают, на п­репарат наносят краску (без промывания). Красить можно 1% сафранином в 50% спирте или метиленовым синим Леффлера. Хо­рошие результаты можно получить, применив для окраски смесь 30 мл метиленового синего Леффлера и 8 мл второго раствора протравы.

Микроскопическая картина. Жгутики приобретают синий цвет.

studfiles.net

Окраска жгутиков серебрением – модификация по Морозову

Реактивы: I
40% формалина (продажного) 1 мл
Дистиллированной воды 100 мл
II
Танина 5 г
Дистиллированной воды
Карболовой кислоты (расплавленной) 1 мл

(Клемпарская предлагает применять, во избежание осадков, протраву в виде 2,5—3% раствора танина.)

Раствор аммиачного серебра (III) готовят по следующей методике: 4 г азотнокислого серебра растворяют в 80 мл дистиллированной воды; затем к нему по каплям добавляют крепкий (25%) аммиак, пока образующийся темно-коричневый, а затем буро-черный осадок не растворится и останется лишь легкая опалесценция. Раствор очень стоек. Хранить в темной склянке с притертой пробкой (защищать от пыли!). Перед окраской реактив разбавляется 1 : 10 дистиллированной водой.

Приготовление бактериальной взвеси. Как правило, жгутики в старых культурах теряются. Иногда необходимы частые систематические пересевы в течение долгого времени на жидкие среды (ежедневные пересевы на свежие среды), пока подвижность микробов не восстановится. Хорошей средой для пересевов является также обыкновенный или кровяной агар, свежий, с влажной поверхностью.

На границе с конденсационной водой осторожно захватывают петлей немного бактериальной массы, переносят ее в пробирку, где налито 0,1—0,2 мл 1% формалина (реактив I), легкими движениями петли распределяют микробные тела в жидкости. До окраски приготовленную эмульсию держат при 37° в течение 2 часов и более (сохраняется годами).

Приготовление стекол. Рекомендуют готовить препарат только на новых, еще не бывших в употреблении, безукоризненно чистых предметных стеклах. Стекла обрабатывают (для очистки) концентрированной соляной кислотой в течение 15 минут; затем кислоту сливают, остатки ее нейтрализуют крепким аммиаком, стекла промывают дистиллированной водой и переносят в чистый винный спирт. Вынутые из спирта (пинцетом!) стекла тщательно протирают мягкой чистой тряпочкой. В чашечку или бюксу, где налито 3—4 мл дистиллированной воды, очень тонкой пипеткой вносят 1 каплю формалиновой бак­териальной взвеси. Отсюда маленькой петлей наносят 5—6 отдельных капель взвеси на центральную часть предметного стекла, не касаясь петлей его поверхности и не размазывая капли. Когда капли высохнут на воздухе, приступают к их окраске.

Техника окраски

1) на препарат (пинцет Корнэ!) наливают протраву (реактив II) и в течение 1—2 минут подогревают до появления паров;

2) тщательно смывают протраву дистиллированной водой (удалению протравы способствуют, протирая стекло вокруг мазка кусочком фильтровальной бумаги);

3) обрабатывают препарат в течение 2—2,5 минут раствором серебра (реактив III) при легком подогревании, пока на препарате не станут видны весьма слабо окрашенные в коричневый цвет округлые пятна (рассматривать белом фоне или при проходящем свете!). Тщательно промывают мазок дистиллированной водой и высушивают на воздухе.

Микроскопическая картина: тела бактерий—угольно-черного цвета, жгутики—в виде тончайших волнообразно извитых нитей коричневого или янтарно-черного цвета на прозрачном или желтоватом гомогенном фоне.

Если жгутики не окрасились, удаляют масло с препарата ксилолом и вторично повторяют процедуру окраски, так как жгутики обнаруживаются только при особенно интенсивной окраске.

В препарате могут быть осадки или грязный фон вследствие переноса на стекло частиц агара, конденсационной воды или при употреблении плохо очищенных стекол, грязного пинцета, наконец, в том случае, если была плохо отмыта протрава.

Если бактериальная эмульсия слишком густа, то бактерии в мазке будут скучены и картина флагелляции вследствие беспорядочного сплетения жгутиков будет неясна. Желательно подобрать такую концентрацию, чтобы в одном поле зрения находилось от 5 до 10 отдельно расположенных бактерий с хорошо расправленными жгутиками.

Заготовляемые для хранения препараты заключают в парафиновое масло или чистый канадский бальзам под покровным стеклом, иначе они быстро обесцветятся под действием света. Несмотря на то, что окрашивание жгути­ков считается одной из тонких микробиологических операций, окраска по Морозову при известной пунктуальности выполнения даже в руках начинаю­щих дает прекрасные результаты.

Способ Уварова

Особенность данного способа окраски жгутиков—отсутствие в протраве танина.

Техника окраски.

1. Культуру освежают двух- трехкратными пересевами на свежий агар и выращиванием при 37° в течение 15—16 часов.

2. Для приготовления эмульсии в физиологический раствор, налитый в чистую пробирку в количестве 5 мл, осторожно погружают петлю со свежей культурой для получения слабой эмульсии. Легкими круговыми вращениями пробирки между ладонями эмульсию равномерно смешивают, затем добавляют в нее одну каплю формалина.

3. Для окраски приготовляют:

а) насыщенный водный раствор калийных квасцов;

б) раствор: сульфаниловой кислоты 0,5 г + соляной кислоты 1,5 мл + 100 мл дистиллированной воды;

в) раствор Мюра: насыщенного водного раствора калийных квасцов 25 мл + насыщенного спиртового раствора генцианвиолета - 5 мл;

г) насыщенный спиртовой раствор основного фуксина. Растворы «а» и «б» смешивают в пропорции 1 : 2. Растворы «в» и «г» смешивают в пропорции 3 : 1.

4. Окраска. Пастеровской пипеткой наносят на чистое предметное текло каплю эмульсии и подсушивают препарат в термостате; на высох­ший нефиксированный препарат наливают смесь растворов «а» и «б», подогре­вают над пламенем при слабом отхождении паров 1—2 минуты, смывают водой и слегка высушивают. Затем на препарат наливают смесь красок «в» и «г» (раствор Мюра и насыщенный спиртовой раствор основного фуксина), нагревают препарат 1—2 минуты до слабых паров, обильно промывают и высушивают.

Микроскопическая картина: жгутики—ярко красно-фиолетового или розовато-фиолетового цвета, тела бактерий—густо фиолетовые.

Способ Леффлера

Приготовленный препарат осторожно фиксируют на пламени горелки и обрабатывают при подогревании в течение 0,5—1 минуты протравой следующего состава: 20% водного раствора танина – 100 мл + насыщенного на холоду водного раствора сернокислого закисного аммиач­ного железа 50 мл + насыщенного спиртового раствора основного фуксина 10 мл. Препарат тщательно обмывают слабой струей воды и слегка высуши­вают на воздухе, затем окрашивают карболовым раствором фуксина при подогревании в течение 2—3 минут, промывают водой и высушивают.

Способ Инуйе

Препарат, приготовленный со всеми предосторожностями, подогревают до появления паров в течение 1—1,5 минут в леффлеровской протраве (см. выше способ Леффлера). Затем протраву смывают водой до прекращения отхождения краски и окрашивают мазок в растворе Мюра, предварительно смешанном и профильтрованном (см. способ Уварова), над пламенем в течение 1-2 минут. Препарат после окраски промывают водой.

Бактерии окрашиваются в темно-фиолетовый, а жгутики—в бледно-фиолетовый, красноватый цвет.

Способ Бениньетти и Джино

За 2—3 дня до окраски готовят следующие растворы:

1) сернокислого цинка 1г + 15г танина + дистиллированной воды 100 мл;

2) насыщенный (при нагревании!) водный раствор квасцов;

3) насы­щенный спиртовой раствор генцианвиолета.

Непосредственно перед окраши­ванием указанные растворы смешивают в пропорции 1 : 2 : 3, смесь обязательно фильтруют, затем наливают на фиксированный препарат, подогревают в течение 2—3 минут, после чего препарат тщательно промывают водой и высу­шивают.

Микроскопическая картина: тела бактерий—темно-фиолетового цвета, жгутики—более нежной окраски. Обычно не во всех точках препарат одинаково хорошо и равномерно окрашивается.

Этот способ наиболее доступен для начинающих и дает вполне удовлет­ворительные результаты.

Page 2

Для выявления полисахаридов можно также исполь­зовать алциановый синий. Обычно применяют 1%-ный (вес/объем) раствор алцианового синего в 95%-ном (объем/объем) этаноле, а в качестве дополнительного красителя используют карболфуксин. Последователь­ность операций такова:

1. Мазок препарата на предметном стекле фиксиру­ют нагреванием.

2. Окрашивают мазок в течение 1 мин. разведенным в 9 раз (в воде) алциановым синим, приготовленным, как описано выше.

3. Отмывают препарат водопроводной водой и высу­шивают.

4. Дополнительно очень быстро окрашивают (не сле­дует допускать перекрашивания!) препарат карболфуксином и сразу же отмывают водопроводной водой. Высушивают мазок на воздухе и смотрят в мик­роскоп.

Полисахариды окрашиваются в голубой цвет, а другие составляющие цитоплазму компоненты—в красный.

Питательные среды

Известно очень много питательных сред для культивирования микроорганизмов (более двух тысяч наименований было классифи­цировано Левином и Шенлейном еще в 1930 г.), но число ингредиентов, являющихся их неотъемлемыми компонентами, отно­сительно невелико. Однако качественный диапазон этих сред весьма широк — от растворов неорганических солей, на которых могут расти автотрофы, до сложных питательных сред, приготавливаемых из мясных гидролизатов, обогащенных кровью или сывороткой; ими обычно пользуются для выделения патогенных микроорганиз­мов типа стрептококков, отличающихся высокой требовательностью к составу питательной среды. Различают два основных типа пита­тельных сред: так называемые синтетические среды, главные состав­ные части которых точно известны (например, глюкозо-солевая питательная среда), и эмпирически подобранные питательные среды природного происхождения, состав которых точно неизве­стен (к ним относятся пептоны, приготавливаемые из частично гидролизованного белка).

Выбор питательной среды зависит в значительной степени от цели эксперимента. Герберт настойчиво высказывался за по­всеместное использование синтетических питательных сред. Однако следует признать, что они обладают рядом практических неудобств. Микроорганизмы, выращенные на таких питательных средах, обычно фенотепически отличаются от выращенных на питательных средах естественного происхождения типа бульона (например, по составу и по скорости деления). Размножение микроорганизмов на таких средах обычно легче подавляется избыточной аэрацией или токсическими катионами; они также более чувствительны к нарушениям баланса между некоторыми составными частями питательной среды, особенно аминокислотами. Многие бактерии нуждаются в большом числе факторов роста, и для некоторых из них до сих пор не найдены искусственные среды, на которых они могли бы размножаться. Возможно, что все эти неудобства со временем будут преодолены, но пока среды неизвестного состава ти­па бульонов, приготовленных из перевара, используются весьма ши­роко, хотя они и вносят в эксперимент неконтролируемые факторы.

В литературе опубликованы результаты количественных анали­зов многих питательных сред природного происхождения, что является определенным шагом на пути к их стандартизации. Однако данными этих анализов следует пользоваться с осторожностью, поскольку результаты определений, проведенных независимо друг от друга, демонстрируют существенные различия состава различ­ных партий одной и той же питательной среды. Более того, при проведении анализов обычно игнорируется наличие в питательных средах многих существенно важных составных частей, хотя ясно, что компоненты, требуемые в следовых количе­ствах, например витамины и катионы, могут присутствовать в исклю­чительно малой концентрации. При этом может оказаться, что размножение бактерий идет нормально, тогда как про­цессы типа споруляции или адсорбции фага ингибируются.

В состав сред, применяемых для выращивания бакте­рий, входят необходимые для построения белков цитоплазмы элементы: азоты, углерод, водород, кислород, неорганиче­ские соединения, содержащие фосфор, калий, серу, натрий, магний, железо, микроэлементы: кобальт, йод, марганец, бор, цинк, молибден, медь и др. Все перечисленные элементы должны находиться в питательной среде в удобоусвояемом для данного микроорганизма соединении, причем требования различных микробов в этом отношении неодинаковы. Потреб­ность в кислороде и водороде бактерии удовлетворяют глав­ным образом за счет поступающей в клетку воды.

По характеру усвоения азота патогенные микроорганиз­мы делятся следующим образом: одни из них извлекают азот из простых аммонийных соединений, другие нуждаются в аминокислотах, третьи расщепляют высокомолекулярные вещества — пептоны, представляющие собой продукты непол­ного ферментативного переваривания белков. Строго пара­зитические виды бактерий размножаются только в присут­ствии нативного, т. е. неизмененного, белка.

Источником углерода для патогенных бактерий являются главным образом различные углеводы: сахар, многоатомные спирты, органические кислоты и их соли.

Потребность бактерий в неорганических элементах удов­летворяется прибавляемыми к питательной среде солями: NaCI, Kh3PO4, K2HPO4 и т. д. Микроэлементы, выполняющие роль катализаторов химических процессов, необходимы в ничтож­но малых количествах и поступают в питательную среду с пептоном, неорганическими солями и водой.

Наряду с перечисленными органическими и неорганиче­скими элементами бактерии нуждаются в ростовых факторах, которые по своей роли соответствуют витаминам для живот­ных. Источником факторов роста являются прибавляемые к питательной среде продукты растительного и животного про­исхождения, содержащие в своем составе никотиновую, пантотеновую, парабензойную кислоты, витамины А, В, С и др.

Питательные вещества могут усваиваться микробами только при определенной реакции питательной среды, так как проницаемость оболочек микробных клеток изменяется в зависимости от рН среды.

Потребность в питательных веществах и физических усло­виях у различных видов микробов неодинакова и этим ис­ключается возможность создания универсальной питательной среды.

По консистенции различают плотные и жидкие пи­тательные среды. Плотные питательные среды готовят из; жидких посредством прибавления к ним клеевых вещество агара или желатина. Агар-агар (по малайски – желе)—про­дукт растительного происхождения, добываемый из морских водорослей. В воде агар-агар растворяется при температуре 80—86°С, застудневает при 36—40°С. Применение агаровых сред благодаря их способности сохранять плотность при тем­пературе 37°С дало возможность выращивать патогенных микробов при оптимальной для большинства из них темпера­туре на плотных средах. Желатин—вещество белковой при­роды животного происхождения. В теплой воде при темпера­туре 32—34°С он набухает и растворяется, а при более низ­кой температуре превращается в студень. Однако при рН ниже 6,3 и выше 7,0 плотность желатина уменьшается, и он плохо застывает.

Исходные продукты для приготовления пи­тательных сред. Для приготовления питательных сред используют:

· Продукты животного происхождения (мясо, рыба, ка­зеин, молоко, яйца, кровь и т. д.).

· Продукты растительного происхождения (картофель и др.).

· Органические и неорганические соединения определен­ного химического состава.

Питательные среды, приготовленные из продуктов расти­тельного и животного происхождения, несмотря на то, что они не могут быть стандартны и не имеют определенного химического состава, находят широкое применение в прак­тике микробиологии. Синтетические питательные среды, со­ставленные из химических соединений, используют пре­имущественно для изучения обмена веществ микробной клетки.

Требования, предъявляемые к питатель­ным средам. Питательные среды должны:

· Содержать необходимые для питания микроба питательные вещества.

· Иметь реакцию рН, оптимальную для выращиваемого вида микроба.

· Иметь достаточную влажность, так как микробы пита­ются по законам диффузии и осмоса.

· Обладать изотоничностью.

· Быть стерильными, обеспечивая тем самым возмож­ность выращивания чистых культур микробов.

Питательные среды подразделяются на среды общего назначения и специальные.

К первой группе отно­сятся мясо-пептонные: агар, бульон, питательный желатин. Среды общего назначения используют для выращивания мно­гих патогенных микробов и применяют в качестве основы для приготовления специальных сред, добавляя к ним кровь, сахар, молоко, сыворотку и другие ингредиенты, необходи­мые для размножения того или иного вида микроба.

К специальным питательным средам относятся электив­ные (избирательные) и дифференциально-днагностическне.

Элективные (избирательные) среды. Принцип создания элективных питательных сред основан на удовлетворении ос­новных биохимических и энергетических потребностей того вида микроба, для культивирования которого они предназназначены. Определенный состав и концентрация питательных микроэлементов, ростовых факторов при строго значении рН обеспечивают оптимальные условия для выращивания одного или нескольких видов микроорганизмов. При посеве на них материала, содержащего смесь раз­личных микроорганизмов, раньше всего будет проявлять­ся рост того вида, для которого данная среда будет электив­ной.

Дифференциально-диагностические питательные среды. Дифференциально-диагностиче­ские питательные среды ис­пользуют для определения видовой принадлежности иссле­дуемого микроба, основываясь на особенностях его обмена веществ. По своему назначению дифференциально-диагности­ческие питательные среды подразделяются следующим об­разом:

· Среды для выявления протеолитической и гемолитической способности микробов, содержащие в своем составе бел­ковые вещества: кровь, молоко, желатин, свернутую кровя­ную сыворотку и т. д.

· Среды с индифферентными химическими веществами, которые служат источником питания для одних видов микро­бов и не усваиваются другими видами.

· Среды с углеводами и многоатомными спиртами для обнаружения соответствующих ферментов.

· Среды для определения редуцирующей способности микробов.

В состав дифференциально-диагностических сред, пред­назначенных для выявления сахаролитических и окислитель­но-восстановительных ферментов, вводят индикаторы: ней­тральную красную, метиленовый синий, лакмусовую настой­ку, кислый фуксин, бромтимоловый синий, водный голубой краситель и розоловую кислоту. Изменяя свою окраску при различных значениях рН, индикатор указывает на нали­чие или отсутствие расщепления, окисления или восстанов­ления введенного в среду ингредиента. Однако индикатор не является обязательной составной частью сред, предназначен­ных для выявления ферментов. Так, наличие желатиназы и других протеолитических ферментов в культуре определяют по разжижению желатина, свернутого яичного или сыворо­точного белка.

Сухие питательные среды. Приготовление питательных сред — один из наиболее ответственных и трудных участков работы бактериологической лаборатории. В связи с этим биопромышленность выпускает стандартные, консервированные, сухие питательные среды, различного назначения, для культивирования микроорганизмов.

Приготовление обычных питательных сред. Основой для приготовления этих сред служит мясная вода, содержащая экстрактивные вещества.

Посуда. Питательные среды готовят в кастрюлях, эмалированных или из нержавеющей стали. Готовые питательные среды разливают во флаконы, пробирки, чашки.

Новую стеклянную посуду кипятят в 1—2% растворе соляной кис­лоты для нейтрализации растворимой щелочи, затем тщательно промывают в проточной воде и сушат. Посуду, бывшую в употреблении, стерилизуют, затем моют, прополаскивают и сушат. Сухие флаконы, колбы, пробирки закрывают ватно-марлевыми пробками.

Мясная вода.

1. 500 г свежей говядины или телятины, освобождают от костей жира и сухожилий, пропускают через мясорубку, фарш заливают 1 литром водопроводной воды, хорошо размешивают. Оставляют на сутки в прохладном месте или помещают на 2 часа в термостат.

2. Мясную пасту отжимают через марлю, кипятят в течение 5 мин. Для свертывания белков, дают остыть. Фильтруют через ватный фильтр, доливают водой до первоначального объема. Мясную воду разливают во флаконы, стерилизуют 20-30 минут при 120° и сохраняют в темном месте. Она имеет вид прозрачной желтоватой жидкости слабокислой реакции (рН 6,2—6,4), без белков. В мясной воде содержит­ся небольшое количество аминокислот, солей, углеводов, факторов роста и экстрактивных веществ. Для приготовле­ния обычных питательных сред к мясной воде прибавляют сухой пептон, который является первичным продуктом гид­ролиза белка и состоит из смеси альбумоз, полипептидов и аминокислот, полученных путем пептического или триптического переваривания.

На мясокомбинатах для производства сухого пептона ис­пользуют фибрин, кровь и другие отходы. Сушат пептон в распылительной вакуум-сушилке.

Жидкий пептон можно приготовить в лабораторных усло­виях путем пептического переваривания белков.

Пептон Мартена. Свиные желудки (не промытые водой) с обильным слизистым слоем очищают от пленок, жира и пропускают через мясорубку. К фаршу прибавляют воду и соляную кислоту в следующем соотношении: фарш из свиных желудков 250 г, вода водопроводная, нагретая до 50°, 1000 мл, соляная кислота (удельный вес 1,18) 10 мл. Смесь выдерживают в термостате при 50°. Через 24 часа пептон прогревают в автоклаве при 100° и фильтруют, фильтрат подщелачивают 10% раствором NaOH до щелоч­ной реакции по лакмусу. После этого фильтрат разливают в колбы и стерилизуют при 115°С 30 минут.

Для приготовления бульона пептон Мартена смешивают с равным объемом мясной воды, устанавливают необходи­мую реакцию, кипятят 30 минут, фильтруют и стерилизуют при 115° 30 минут.

Мясо можно переваривать с помощью трипсина — пере­вар Хоттингера, при этом более полно используют белки мя­са, которые расщепляются до пептонов, полипептидов и сво­бодных аминокислот. При триптическом переваривании мя­са получают в 10 раз больше бульона, чем при обычном методе.

Мясной перевар Хоттингера. Мясо, освобож­денное от жира и сухожилий, нарезают небольшими кусоч­ками, помещают в кастрюлю с кипящей водопроводной во­дой (в полуторном объеме) и кипятят 15—20 минут, затем мясо извлекают из жидкости и пропускают через мясорубку. Установив рН охлажденной до 40—45° жидкости, равный 8, заливают ею фарш. К полученной смеси добавляют сухой панкреатин в количестве 0,5—1% или поджелудочную же­лезу из расчета 100 г железы на 1 л жидкости. Затем смесь снова подщелачивают до рН 8 и разливают ее в бутыль. Туда же добавляют 2—3% хлороформа и, закрыв бутыль резиновой пробкой, несколько раз встряхивают содержимое. Бутыль ставят на 7—14 суток при температуре 37°.

В результате переваривания мясной фарш превращается в гомогенный сероватый осадок, над которым находится со­вершенно прозрачная жидкость соломенно-желтого цвета. Перевар Хоттингера хорошего качества дает положитель­ную реакцию на триптофан и содержит 560—860 мг% аминного азота. Для приготовления бульона к 1 части перевара прибавляют 6—7 частей воды.

Мясо-пептонный бульон (МПБ).

1. В 1 л мяс­ной воды растворяют при подогревании и помешивании 10 г пептона (1%) и 5 г (0,5%) хлористого натрия. Рекоменду­ется брать 3 части хлористого натрия и 2 части двузамещенного фосфорнокислого натрия. Смесь вводится в количестве 0,5%. Фосфорнокислый натрий стабилизирует реакцию сре­ды и служит дополнительным источником фосфора. Уста­навливают рН среды до 7,6—7,8, кипятят 30—45 минут до выпадения осадка.

2. Охлаждают, фильтруют через бумажный фильтр, доли­вают водой до первоначального объема, проверяют рН.

3. Разливают по пробиркам, флаконам и стерилизуют 15— 20 минут в автоклаве при 120°.

Концентрированный мясо-пептонный бульон готовят на особой мясной воде (1 кг мяса заливают 1 л воды). Такой бульон служит для выращивания анаэробных и других мик­робов.

Мясо-пептонный агар (МПА).

1. К мясо-пептонному бульону для придания плотности добавляют 2—2,5% мелко нарезанного и промытого агар-агара.

2. Кипятят, помешивая до полного расплавления агара. В некоторых случаях для просветления среды прибавляют белок одного куриного яйца, смешанного с двойным коли­чеством холодной воды. Среду помещают в автоклав на 45 минут при 115°. Свернувшиеся хлопья белка адсорбируют взвешенные частицы и осаждаются на дно.

Агар-агар получают путем специальной обработки морских водо­рослей. Он является веществом полисахаридной природы, содержит незначительное количество азота и не представляет собой питательный субстрат. Студень, образуемый агар-агаром, расплавляется при 70— 100°C и застывает при 40—50°.

3. Проверяют и исправляют реакцию среды. Отстаивают и фильтруют через ватно-марлевый фильтр в горячем авто­клаве или в специальной металлической воронке с двойными стенками, между которыми находится горячая вода.

4. Разливают среду через стеклянную воронку с зажимом в пробирки и флаконы и стерилизуют в автоклаве при 120° в течение 15—20 минут.

5. Из расплавленного стерильного мясо-пептонного агара приготовляют скошенный и прямой агар (агар столбиком). В первом случае пробирки укладывают горизонтально до полного застывания, во втором — пробирки помещают в штатив вертикально.

В настоящее время бактериологические лаборатории ши­роко используют сухие питательные среды в ви­де порошков, хранящихся в герметически закрытых банках и пакетах. Кроме обычных питательных сред (МПБ и МПА), имеются специальные и дифференциально-диагнос­ти­че­ские среды. Го­товят среды по прописи, указанной на этикетке, навеску порошка растворяют в определенном объеме дистиллирован­ной воды, среду разливают в пробирки и стерилизуют при соответствующей температуре. Постоянство состава, стан­дартность среды, простота и удобство в работе, легкость транспортировки и хранения являются большим преимуще­ством сухих питательных сред.

Определение рН (концентрации водородных ионов) питательной среды производят колориметрическим методом. Известно, что дистиллированная вода имеет рН 7 (отрица­тельный логарифм числа водородных ионов). Выше идут по­казатели щелочной реакции, ниже 7 — показатели кислой реакции. Для определения рН по методу Михаэлиса имеют­ся наборы стандартов от рН 5,4 до рН 8,4, индикаторы — 0,1% раствор паранитрофенола, 0,3% раствор метанитрофенола и компаратор.

Рис. 3. Компаратор Михаэлиса. 1—вид спереди; 2—вид сзади;

Определение рН производится в компараторе (рис. 4)— специальном штативе с 6 гнездами. В этих гнездах разме­щают пробирки в определенном порядке. Во 2-е гнездо ста­вят пробирку с 2 мл испытуемой среды, 4 мл дистиллирован­ной воды и 1 мл индикатора, рядом в 1-е и 3-е—такие же пробирки и наливают в них по 2 мл испытуемой среды и 5 мл дистиллированной воды. В 5-е гнездо помещают про­бирку с дистиллированной водой, в 4-е и 6-е — стандарты с показателями, близкими заданной реакции. Например, не­обходимо установить реакцию рН 7,4. В 4-е гнездо ставят стандартную пробирку с рН 7,2, а в 6-е—с рН 7,4. Желто­ватый цвет среды при описанном размещении пробирок компенсируется тем, что между пробирками со стандартом и источником света устанавливают пробирку, в которой на­лита среда без индикатора. Пробирку рассматривают на свет через нижние отверстия компаратора на фоне голубой пластинки. Если в приведенном примере цвет исследуемой среды совпадает с цветом стандарта рН 7,2, а необходимо приготовить среду с цветом стандарта рН 7,4, то ко второй пробирке содержащей 2 мл испытуемой среды и индикатор, микропипеткой прибавляют N/20 раство­ра NaOH (4% раствор NaOH, разведенный в 20 раз) до тех пор, пока цвет содержимого этой пробирки совпадет со стандартом рН 7,4. Так, для 2 мл среды потребовалось 0,32 мл N/20 NaOH. Для приготовления 1000 мл среды не­обходимо произвести расчет по уравнению:

(мл)

т. e. к 1 л питательной среды нужно прибавить 160 мл N/20 раствора или 8 мл нормального раствора щелочи. Этот спо­соб дает возможность установить рН больших количеств питательной среды.

Для определения рН плотных питательных сред их рас­плавляют и наливают в пробирки компаратора горячую дистиллированную воду. Возможно определение pH с использованием pH-метров.

После установления соответствую­щего рН среду кипятят, фильтруют, осветляют, разливают во флаконы, пробирки и стерилизуют. Следует учитывать, что после стерилизации среда становится более кислой.

Стерилизация питательных сред. Стерилизацию питательных сред осуществляют различными способами в зависимо­сти от тех ингредиентов, которые входят в их состав.

1. Синтетические среды и все агаровые среды, не содер­жащие в своем составе нативного белка и углеводов, стери­лизуют 15—20 мин в автоклаве при температуре 115—120°С.

2. Среды с углеводами и молоком (в состав которого вхо­дит лактоза), питательный желатин стерилизуют текучим паром при температуре 100°С дробно или в автоклаве при 112°С.

3. Среды, в состав которых входят белковые вещества (сыворотка крови, асцитическая жидкость), обеспложивают­ся тиндализацией или фильтрованием.

4. Для стерилизации питательных сред, содержащих в своем составе нативные белки, пользуются фильтрацией че­рез мембранные фильтры Зейтца.

Подготовленные к употреблению питательные среды про­веряют на стерильность. Для этого их ставят в термостат при температуре 37°С. Среды, простерилизованные в автоклаве, выдерживают в термостате 1 сут., простерилизованные теку­чим паром — 3 сут.

Page 3

1. При посеве в жидкую питательную среду петлю с находя­щимся на ней материалом погружают в среду. Если матери­ал вязкий и с петли не снимается, его растирают на стенке сосуда, а затем смывают жидкой средой. Жидкий материал, набираемый в пастеровскую или градуированную пипетку, вливают в питательную среду.

2. При посеве на скошенный мясо-пептонный агар про­бирку берут в левую руку между I и II пальцами, чтобы ос­нование пробирки находилось на поверхности кисти руки и посев осуществлялся под контролем глаза. Пробку из про­бирки вынимают правой рукой V и IV пальцами, не прика­саясь к той части пробки, которая входит внутрь пробирки. Остальные 3 пальца правой руки остаются свободными для взятия бактериальной петли, посредством которой произво­дится посев. Петлю держат, как писчее перо. После вынима­ния пробки пробирку с питательной средой держат в наклон­ном положении во избежание попадания в нее посторонних микроорганизмов из воздуха.

Петлю с находящимся на ней пересеваемым материалом вводят в пробирку до дна, опускают плашмя на поверхность питательной среды и скользящими движениями наносят штрих снизу вверх, от одной стенки пробирки к другой (Рис. 4).

3. При посеве на поверхность плотной питательной среды в чашки Петри чашку держат в левой руке. Дно ее с одной стороны придерживают I и II пальцами, а с другой — IV и V пальцами. Крышку, приоткрытую настолько, чтобы в об­разовавшуюся щель свободно проходили петля или шпатель, фиксируют I и III или I и II пальцами (Рис. 5). Небольшое количество исследуемого материала втирают бактериальной петлей в поверхность питательной среды у края чашки. За­тем петлю прожигают, чтобы уничтожить избыток находяще­гося на ней материала. Линию посева начинают с того ме­ста, в котором находится материал. Бактериальную петлю кладут плашмя на питательную среду, чтобы не поцарапать ее поверхности, и проводят штрихи по всей среде или по сек­торам, разграфив предварительно дно чашки (при условии, что среда прозрачна) на несколько равных частей. Нужно стараться, чтобы штрихи, наносимые петлей, располагались как можно ближе друг к другу, так как это удлиняет общую линию посева и дает возможность получить изолированные колонии микроорганизмов.

Рис. 5. Посев на плотную питательную среду в чашки Петри.

Для равномерного распределения засеваемого материала по поверхности плотной питательной среды можно пользо­ваться вместо петли тампоном или шпателем.

При обилии в засеваемом материале микробов они растут в виде пленки, покрывающей всю поверхность питательной среды. Такой характер микробного роста получил название сплошного, или газонного. Посев газоном производят, когда нужно получить большие количества микробной культуры одного вида.

4. Из материала, подлежащего посеву в толщу плотной питательной среды, готовят взвесь в стерильной водопровод­ной воде или в изотоническом растворе. Набирают 0,1—1 мл взвеси в пипетку (в зависимости от степени предполагаемого микробного загрязнения) и выливают в пустую стерильную чашку Петри. Вслед за этим чашку заливают 15—20 мл мясо-пептонного агара, расплавленного и остуженного до тем­пературы 40—45°С (при такой температуре пробирка со сре­дой, приложенная к щеке, не должна вызывать ощущения ожога). Для равномерного распределения исследуемого ма­териала в питательной среде закрытую чашку с содержимым слегка вращают по поверхности стола.

5. Посев уколом в столбик питательной среды производят в пробирку со средой, застывшей в виде столбика. Пробир­ку берут в левую руку, как обычно, и в центре столбика до дна пробирки вкалывают петлю с находящимся на ней мате­риалом.

Получение чистых культур

Чистой культурой микробов называют популяцию микроорганизмов одного вида, полученную из изолированной микробной колонии. Под микробной колонией подразумевает­ся потомство бактерий, возникающее в результате размно­жения одной микробной клетки.

Выделение чистой культуры микробов является обяза­тельным этапом всякого бактериологического исследования. Чистая культура необходима для изучения морфологических, культур культуральных, биохимических и антигенных свойств, по со­вокупности которых определяется видовая принадлежность исследуемого микроорганизма.

Для выделения чистых культур микробов из материалов, содержащих обильную смешанную микрофлору, предложено много различных методов. Наибольшее распространение по­лучил метод механического разъединения микроорганизмов, находящихся в исследуемом материале, с целью получения изолированных колоний на поверхности или в глубине пита­тельной среды.

Очень широко применяются элективные питательные сре­ды, стимулирующие развитие тех микроорганизмов, чистую культуру которых предполагается выделить.

Некоторые виды микробов обладают высокой чувствитель­ностью к воздействию определенных факторов внешней сре­ды. Индивидуальная устойчивость микробов к тому или ино­му фактору была использована для разработки методов вы­деления чистых культур путем умерщвления сопутствующей микрофлоры. Этим способом производится выделение споpoвых форм микробов, устойчивых к действию высокой температуры, микробактерий туберкулеза, безразличных к действию концентрированных растворов минеральных кислот, в отли­чие от остальных микробов, содержащихся в мокроте.

При выделении чистой культуры патогенных микробов из патологического материала, загрязненного посторонней мик­рофлорой, прибегают иногда к заражению лабораторных жи­вотных, восприимчивых к тому виду микроба, который пред­полагается выделить из исследуемого материала. Биологи­ческий метод выделения чистой культуры применяется при исследовании мокроты на содержание в ней пневмококков, микобактерий туберкулеза.

Для выделения бактерий в виде чистых культур из­вестно сравнительно мало методов. Чаще всего это де­лают путем изолирования отдельных клеток на твердой питательной среде, используя метод посева штрихом или разлива по чашкам небольшого количества жидкой культуры. Однако получение отдельной колонии не всег­да гарантирует чистоту культуры, поскольку колонии могут вырасти не только из отдельных клеток, но из их скоплений. Если микроорганизмы образуют слизь, то к ней часто прикрепляются посторонние формы. В слу­чае выделения штаммов Bacillus или актиномицетов контаминирующие микроорганизмы могут быть опутаны цепочками клеток или соответственно гифами этих бак­терий. Для очистки предпочтительнее использовать не­селективную среду, поскольку на ней лучше растут кон­таминирующие микроорганизмы и их легче обнаружить. Но даже на неселективной среде не следует очень быст­ро отбирать колонии, поскольку за данный отрезок вре­мени могут еще не вырасти медленно растущие кон­таминирующие бактерии.

Из чистой культуры обычно вырастают одинаковые колонии и при микроскопировании выявляются похожие клетки, в частности по размеру и окраске по Граму. Однако возможны исключения, например, колонии, вы­растающие из чистой культуры, могут быть гладкие (S) и шероховатые (R). Кроме того, в чистых культурах различных микроорганизмов могут появиться кокковидные клетки, цисты и споры. Наконец, некоторые микро­организмы проявляют грамвариабельность. Тем не ме­нее указанные критерии широко используются при опре­делении чистоты культур.

Посев штрихом

Существует много методов посева штрихом в чашки с твердыми средами («штрихованные чашки»), но лишь некоторые из них почти всегда дает хорощо изоли­рованные колонии даже при отсутствии навыков у экс­периментатора. Кроме того, можно наливать разведен­ные растворы смешанной культуры на поверхность твер­дых сред в чашках. При работе с анаэробами «штрихованные чашки» или чашки с внесенной в них жидкой культурой в атмосфере воздуха инкубируют затем в анаэростате. Для анаэробов необходимы свежеприготовленные среды, и посев штрихом следует проводить в течение первых 4 ч после их автоклавирования, чтобы избежать накоп­ления растворенного кислорода.

В Г Д

Рис. 6. Удобный метод по­сева штрихом в чашки для получения отдельных коло­ний. А. Для маркировки на обратной стороне чашки Петри карандашом наносят букву Т, разделяющую дно на 3 сектора. Б. Петлей с культурой зигзагом наносят штрихи на поверхности ага­ра в секторе 1, как показано на рисунке. Для этого крыш­ку чашки сначала приподни­мают, а после нанесения штриха сразу закрывают. Петлю стерилизуют в пламе­ни и дают ей остыть (15 с). В. Проводят петлей по по­верхности среды в секторе 1, как показано на рисунке, и затем немедленно наносят ею зигзагом штрихи на по­верхности среды в секторе 2. Прогревают петлю в пла­мени и дают ей остыть. Г. Проводят петлей по поверх­ности среды в секторе 2, как показано, и затем наносят ею зигзагом штрихи на по­верхности среды в секторе 3. Д. Инкубируют опрокинутые вверх дном чашки, как по­казано на рисунке, для того чтобы конденсирующаяся во­да с крышки не попала на поверхность агара. В секто­ре 1 вырастает большое чис­ло колоний, тогда как в сек­торах 2 и 3 появляются от­дельные хорошо изолирован­ные колонии.

Page 4

Для изуче­ния свойств колоний микробы культивируют на плотных пи­тательных средах в чашках Петри. При посеве материала стараются получить изолированный рост колоний. Чашки с посевом просматривают сначала невооруженным глазом или через лупу, затем помещают их на столик микроскопа вверх дном и просматривают колонии в проходящем свете с объ­ективом малого увеличения и с суженой диафрагмой.

Колонии характеризуют по величине, форме, контуру края, рельефу, поверхности, цвету, структуре и консистенции.

Величина колонии определяется ее диаметром. В за­висимости от диаметра различают колонии точечные (диа­метр меньше 1 мм), мелкие (диаметр 1—2 мм), средние (диаметр 2—4 мм) и крупные (диаметр 4—6 мм и более).

Форма колонии бывает правильная — круглая, непра­вильная — амебовидная, ризоидная — корневидная, напоминающая переплетающиеся корни деревьев.

Характер контура края определяют при рассмотрении колонии под лупой или микроскопом с малым увеличением. Различают ровные края в виде четко выраженной ли­нии и неровные. Последние делят на:

1) фестончатый край, состоящий из крупных, слегка округ­лых или уплощенных зубцов правильной формы;

2) волнистый край, который несколько отличается от фе­стончатого тем, что крупные зубцы его выражены нечетко;

3) эрозированный, или зазубренный, край, состоящий из острых зубцов различной величины и формы;

4) бахромчатый край, имеющий нежные ворсинки. В некоторых случаях четко выраженная линия, отграни­чивающая колонию от поверхности среды, отсутствует. Такой край колонии называется расплывчатым.

Рельеф колонии характеризуется приподнятостью ее над поверхностью питательной среды и контуром формы в вертикальном разрезе. Определяется рельеф колонии нево­оруженным глазом или с лупой при рассматривании сверху и сбоку. Различают:

1) каплеобразные и куполообразные колонии правильной круглой формы с различно выраженной степенью выпукло­сти, которые в вертикальном разрезе представляют собой сегмент шара и отличаются только длиной радиуса. Коло­нии слабовыпуклые имеют большую длину радиуса; куполо­образные — меньшую;

2) колонии плоско-выпуклые с плоским верхом, пологими или круто обрывающимися краями; имеют в вертикальном разрезе форму трапеции;

3) колонии конусообразные, имеющие в вертикальном разрезе форму треугольника:

4) колонии с приподнятой в виде соска серединой и ва­ликом по периферии;

5) колонии с вдавленным центром;

6) колонии плоские, стелющиеся по поверхности среды.

Поверхность колонии изучают с помощью лупы или под микроскопом при малом увеличении. Поверхность коло­ний бывает матовая или блестящая с глянцем, сухая или влажная, гладкая или шероховатая. Гладкие колонии обозна­чают буквой S (smooth), шероховатые — буквой R (rough), что означает соответственно «гладкий» и «шероховатый». Ме­ханизм формирования гладких и шероховатых форм колоний обусловлен различием процессов клеточного деления. Мик­робные клетки в колониях S-форм располагаются, соприка­саясь своими боковыми поверхностями, клетки R-форм, сохраняя при делении цитоплазматические мостики, об­разуют цепочки, которые, накладываясь друг на друга, об­условливают шероховатую поверхность и неровный край колонии.

Переход S-форм в R-формы наблюдается при диссо­циации. Явление диссоциации у патогенных микробов на­блюдается под действием антибиотико- и химиотерапии, фак­торов специфического иммунитета, формирующихся в течение инфекционного процесса, а также факторов внешней среды. Среди шероховатых форм колоний различают: складча­тые, гирозные, по виду напоминающие исчерченную извили­нами поверхность мозга; бородавчатые, концентрически или радиально исчерченные; шагреневые, т. е. мелкозернистые.

Цвет колонии определяется пигментом, который проду­цирует культура микробов. Преобладающее большинство патогенных бактерий пигмента не образует, вследствие чего колонии их бесцветны или молочно-мутного цвета, похожи на опал. В проходящем свете такие колонии в большей или меньшей степени прозрачны. Пигментообразующие виды мик­робов дают колонии различных цветов: кремовые, желтые, золотисто-оранжевые, синие, красные, сиреневые, черные и др.

Структура колоний определяется в проходящем све­те при слабом увеличении микроскопа, суженой диафрагме или при несколько опущенном конденсоре. У пигментирован­ных колоний и колоний, не пропускающих света, она не опре­деляется.

По характеру структуры различают следующие виды ко­лоний:

1) гиалиновые — бесцветные, прозрачные, без видимой определенной структуры;

2) зернистые, которые в зависимости от величины зерен разделяются на мелко- и грубозернистые;

3) нитевидные или волокнистые, характеризующиеся на­личием длинных, густо переплетающихся нитей в толще ко­лонии.

Колонии бывают однородные и неоднородные. Строение первых одинаково во всех частях, у вторых центральная часть отличается от периферической или отдельные сектора имеют строение, неодинаковое с остальной массой.

Консистенцию колонии, определяющую ее физиче­ское состояние, исследуют посредством прикосновения или взятия из нее части материала бактериальной петлей. По характеру консистенции колонии бывают:

1) пастообразные, легко снимающиеся и размывающиеся по поверхности питательной среды наподобие сливочного масла;

2) вязкие или слизистые, прилипающие и тянущиеся за петлей;

3) волокнистые или кожистые, плотные, снимающиеся с поверхности питательной среды в виде упругой пленки, соот­ветствующей величине и форме колонии;

4) хрупкие, сухие, рассыпающиеся при прикосновении петли.

Page 5

Некоторые виды микроорганизмов продуцируют и выделяют во внешнюю сре­ду протеолитические ферменты — протеазы, катализирующие расщепление белков. В результате расщепления молекулы белка образуются высокомолекулярные промежуточные про­дукты распада — пептоны, альбумозы и полипептиды. Под действием других протеолитических ферментов пептоны в свою очередь расщепляются на полипептиды (соединения двух или нескольких аминокислот) и отдельные аминокис­лоты.

Для выявления протеолитических ферментов исследуемую культуру микроба засевают в питательную среду, содержа­щую тот или иной белок. Чаще всего для этой цели приме­няют желатин, реже — свернутую лошадиную сыворотку, коа­гулированный яичный белок, молоко или кусочки вареного мяса.

Протеолитическая активность одного и того же микроба при определении ее на разных питательных средах будет проявляться неодинаково, что обусловлено специфичностью ферментов. Поэтому для разных видов микробов рекоменду­ют питательные среды различного состава.

Определение протеолитической активно­сти микробов

а) На желатине. Мясо-пептонный желатин разливают в пробирки столбиком по 5— 6 мл. Посев производят уколом, погружая петлю с исследуе­мой культурой в глубь питательной среды до дна пробирки. Микробы, способные расти при низкой температуре, остав­ляют стоять в комнате при 20—22°С. Остальные посевы ин­кубируют в термостате при 37°С. Вместе с опытными про­бирками в термостат ставят одну или две пробирки с неза­сеянным желатином для контроля. При температуре 37°С желатин плавится, поэтому после инкубации пробирки, вы­нутые из термостата, опускают в холодную воду или ставят в холодильник. После застудневания желатина в контроль­ных пробирках приступают к просмотру роста и учету изме­нений в питательной среде опытных пробирок. Там, где под действием фермента желатиназы произошло расщепление белков желатина, отмечается разжижение питательной сре­ды. Пробирки, в которых после суточного инкубирования среда остается без изменения, оставляют в термостате. Наблю­дение за изменением среды ведется в течение 20 сут. В прото­коле исследования обязательно отмечают день появления признаков разжижения среды, степень и характер ее разжи­жения.

б) На молочном агаре Эйкмана. Молочный агар Эйкмана, разлитый и остуженный в чашках Петри, засевают исследуемой культурой микробов. Посев делают петлей или шпателем так, чтобы получить изолированные ко­лонии. Через 24—48 ч инкубации в термостате культуры, продуцирующие протеолитический фермент, обусловливают пептонизацию молочного белка — казеина, в результате чего вокруг таких колоний образуются прозрачные зоны, четко выделяющиеся на общем молочно-мутном фоне среды.

в) На свернутой кровяной сыворотке. Куль­туру исследуемых аэробных микробов засевают на чашки, анаэробных — уколом в столбик свернутой лошадиной сыво­ротки, инкубируют в термостате при 37°С. Штам­мы, продуцирующие протеолитические ферменты, разжижая питательную среду, образуют углубления вокруг колоний или на поверхности столбика среды.

г) В бульоне с куриным яичным белком. В пробирку с мясо-пептонным бульоном или бульоном Хоттингера, содержащим кусочек свернутого куриного белка, вносят одну петлю исследуемой культуры микроба. Посевы просматривают ежедневно в течение 5 дней. Протео-литически активные культуры микробов расщепляют коагу­лированный яичный белок; кусочки белка, содержавшиеся в среде, заметно уменьшаются в размере, превращаясь в крошкообразную массу, или полностью растворяются.

Аналогичным образом проявляются протеолитические свойства микробов в средах с кусочком вареного мяса.

Некоторые виды патогенных микробов с выраженной про­теолитической активностью обладают способностью расщеп­лять белок и пептон до продуктов глубокого распада: индо­ла, сероводорода, мочевины и аммиака.

При определении видов и дифференциации разновидно­стей патогенных микробов наибольшее значение имеет выяв­ление двух первых продуктов: индола и сероводорода.

Определение индола в культуре микроор­ганизмов

Индол образуется при расщеплении сложной гетероциклической кислоты — триптофана. Для выявления индолообразования петлю исследуемой культуры засевают в среду Строгова или другие среды, рекомендуемые для обнаружения индола. Тотчас после посева в пробирку вносят полоску индикаторной бумаги, пропитанную раствором щавелевой кислоты, так, чтобы индика­торная бумага не касалась питательной среды. Для этого верхнюю треть бумажной полоски прижимают пробкой к стенке пробирки. Посевы инкубируют 24—48 ч при темпера­туре 37°С. Образование индола определяют по окрашиванию нижнего конца индикаторной бумаги в бледно-розовый цвет, хорошо заметный в проходящем свете.

Определение сероводорода

Сероводород яв­ляется конечным продуктом расщепления аминокислот: цистина, цистеина и метионина, содержащих серу. Петлю ис­следуемой культуры микробов засевают в пробирку с мясо-пептонным бульоном или бульоном Хоттингера. Тотчас после посева в пробирку вносят пропитанную ацетатом свинца по­лоску индикаторной бумаги на определение сероводорода. В положительных случаях образующийся в культуре сероводород вступает в соединение с бесцветным ацетатом свинца и превращается в сульфат свинца, который придает индикаторной бумаге черно-бурое окрашивание.

Окончательный учет результатов на образование индола и сероводорода проводят на 7—10‑й день после посева, так как процесс ферментативного расщепления белка и образова­ния конечных продуктов распада происходит иногда в тече­ние длительного времени.

Page 6

Для успешного проведения лечения антибиотиками, особенно в случаях хронической инфекции, необходимо предварительно опреде­лить степень чувствительности к антибиотикам микробов, вызвавших заболевание. При определении чувствительности желательно иметь чистые культуры возбудителя и лишь при необходимости срочного получения ответа используют смешанные культуры, содержащие всю микрофлору, имевшуюся в исследуемом материале.

Наиболее прост и доступен метод определения чувствительно­сти с помощью дисков, пропитанных антибиотиками. В стерильные чашки Петри, расположенные на горизонтальной поверхности, раз­ливают по 15 мл плотной питательной среды (чаще всего 2% агар на переваре Хоттингера, содержащий 0,11—0,13% аминного азота). На поверхность застывшего и слегка подсушенного агара наливают 1 мл суспензии суточной культуры микроба-возбудителя или, если чистая культура не выделена, взятого для исследования патологи­ческого материала (гной, экссудат и т. п.), слегка разведенного изо­тоническим раствором хлорида натрия. Бактериальную взвесь равно­мерно распределяют по поверхности агара, а ее избыток удаляют пастеровской пипеткой. На поверхности засеянного агара пинцетом раскладывают диски с антибиотиками — по 5—6 дисков на каждую чашку на расстоянии 25 мм от центра чашки. Чашки выдерживают при 37°С 16—18 ч, после чего учитывают результаты опыта путем измерения зон задержки роста микробов вокруг дисков, включая диаметр самого диска. Размер зон зависит от степени чув­ствительности возбудителя к данному антибиотику. При зоне диа­метром до 10 мм штамм расценивается как устойчивый, 11–15 мм — как малочувствительный, 15–25 мм — как чувствительный. Зоны, превышающие 25 мм, свидетельствуют о высокой чувстви­тельности микроорганизма к данному антибиотику. Однако этот метод нельзя считать количественным.

Более точные результаты можно получить, применяя метод се­рийных разведений в жидкой среде. Бульон Хоттингера (или другую среду, пригодную для роста данного микроорганизма) разливают по 2 мл в пробирки, расставленные в штативы по 10 в каждом ряду. Готовят раствор антибиотика, содержащий 100 ЕД в 1 мл, и добавляют 2 мл этого раствора в первую пробирку. После тща­тельного перемешивания новой стерильной мерной пипеткой пере­носят 2 мл из этой пробирки в следующую и т. д. до девятой про­бирки, из которой 2 мл выливают. Десятая пробирка, не содержа­щая антибиотика, служит контролем роста культуры. Для поста­новки этого опыта вместо стандартов антибиотиков можно с успехом использовать имеющиеся в продаже препараты, на этикет­ке которых указано количество единиц во флаконе. Например, если флакон содержит 500000 ЕД пенициллина, то, добавив в него 10 мл дистиллированной воды, получают раствор, содержащий в 1 мл 50000 ЕД, при дальнейшем разведении в 100 раз получают раствор с концентрацией пенициллина 500 ЕД/мл. Для получения требуемой концентрации 100 ЕД/мл нужно развести этот раствор еще в 5 раз; это разведение делают при помощи бульона и 2 мл полученного раствора вносят в первую пробирку. Таким образом, в первой пробирке концентрация пенициллина 50 ЕД/мл, во вто­рой — 25 ЕД/мл и т. д. Если на этикетке препарата дозировка указана в весовых единицах, следует иметь в виду, что для большей части антибиотиков 1 г активного вещества соответствует 1 000 000 ЕД. Из этого расчета и следует разводить антибиотик.

Если порошок антибиотика расфасован не мерно, и на этикет­ке указано количество единиц активности в 1 мг, необходимо к точной навеске препарата (20—25 мг), сделанной на аналитических весах, добавить равный объем растворителя, т. е. получить раствор мг/мл, в 1 мл которого содержится столько единиц, сколько их было указано на этикетке. Из этого основного раствора делают дальнейшие разведения по указанной выше схеме. Суточную ага­ровую культуру испытуемого микроба смывают изотоническим раствором хлорида натрия и, определив густоту взвеси по стандарту мутности, разводят до густоты 10000 микробов в 1 мл. Полученную взвесь по 0,2 мл вносят во все пробирки ряда, начиная с контроль­ной. Таким образом, во всех пробирках содержится в 1 мл 1000 микроорганизмов. Результаты опыта учитывают после инкуба­ции при 37°С в течение 18—20 ч. Последняя пробирка с прозрач­ным бульоном при наличии густого роста в контроле определяет минимальную, подавляющую рост данного микроорганизма концен­трацию антибиотика.

Для определения чувствительности микробов к сульфаниламидам может быть применен любой из указанных методов, причем во внимание принимается только степень разведения навески пре­парата. Общую чувствительность к сульфаниламидам, как и к анти­биотикам, можно определить методом канавки. На агаре в чашке Петри по ее диаметру прорезают канавку, в которую вносят опре­деленное разведение изучаемого препарата. Перпендикулярно к канавке засевают штрихом изучаемые культуры микроорганизмов. После инкубации при 37°С 18—20 ч отмечают наличие участков задержки роста микроорганизмов, если последние чувствительны к данному препарату.

Выделение и практическое использование веществ антибиотиче­ской природы основано на взаимоотношениях между микроорга­низмами разных видов.

В настоящее время обнаружены также и антимикробные ве­щества, действующие внутри одного вида, что и отличает их от антибиотиков.

Лабораторные животные

В диагностической работе бактериологических лаборато­рий часто приходится прибегать к заражению так называемых лабо­раторных, или опытных, животных. Чаще всего в повседневной практике применяют для этой цели мелких, наиболее дешевых, животных: белых мышей и крыс, морских свинок, кроликов, а из птиц—голубей и кур. Реже используют собак и кошек, еще реже—различные виды сель­скохозяйственных животных. Цель биологических методов исследования заключается в определении патогенности или степени вирулентности иссле­дуемого материала, выделении из материала чистых культур микробов, отделении патогенных микроорганизмов из смеси с сапрофитными видами и т. д. Широкое применение находят лабораторные животные и в серологической практике: морские свинки—для получения комплемента, кролики (овцы, телята)—при изготовлении различных агглютинирующих сывороток, гемолизина, эритроцитов и т. п. Для изготовления специальных питатель­ных сред от животных получают кровь, сыворотку, различные органы, ткани и т. д. Кроме того, лабораторные животные широко используются при определении качеств биологических и химиотерапевтических препаратов, а также научно-экспериментальной работе. Лабораторные животные служат так­же для диагностики некоторых инфекционных заболеваний, моделирования экспериментальных острых и хронических ин­фекционных процессов, установления вирулентности и токсигенности изучаемых штаммов микробов, определения актив­ности приготовленных вакцин и исследования их на безвред­ность.

Бактериологические лаборатории для повседневной работы обычно разводят лабораторных животных в специально организованных для этой цели питомниках. Это дает возможность всегда получать в достаточном количестве проверенный и безупречного качества подопытный материал. Если животные не разводятся, а только содержатся в лаборатории, то помещения для них носят название – виварий. Новые партии животных закупаются в питомниках. Условия содержания и кормления в данных подразделения практически аналогичны, поэтому в ниже приведенном материале не будет дифференциации между указанными структурами лаборатории.

Page 7

Попол­нение вивария новыми лабораторными животными проводят из государственных специализированных питомников в со­провождении ветеринарного свидетельства, удостоверяюще­го, что животные поступают из хозяйства, благополучного по инфекционным заболеваниям, и клинически здоровы. Живот­ных принимают в чистые, заранее продезинфицированные клетки, размещают в карантинном отделении сроком на 3 дня для адаптации к новым условиям. В период карантина за животными ведется регулярное клиническое наблюдение с ежедневной термометрией и регистрацией общего состоя­ния в специальном журнале по приводимой ниже форме.

Таблица 5.

Журнал регистрации поступления и распределения лабораторных животных в экспериментально-биологической клинике (виварии)

Дата посту­пления Вид живот­ных Пол Масса тела, воз­раст Пос­тав­щик Распреде­ление (No клетки) Наблю­дение во время ка­рантина Дата окончания карантина Кому вы­даны жи­вотные
                 

Для животных, полученных не из государственных питом­ников, устанавливаются следующие сроки карантинирования: для мышей и крыс—14 дней, для морских свинок и кроли­ков—21 день.

В целях предупреждения заноса и распространения ин­фекции в виварии уход и наблюдение за животными, нахо­дящимися в карантине, осуществляются персоналом, закреп­ленным за данным отделением. По этим же соображениям запрещается выносить из карантинного отделения в другие помещения вивария корма, спецодежду и инвентарь.

Чистка и мойка посуды, клеток и другого инвентаря из карантинного помещения производится в общем дезинфек­ционно-моечном отделении вивария только после предвари­тельного обеззараживания. Методы дезинфекции в каждом конкретном случае определяются соответственно специфике работы учреждения.

В случае появления в карантинном отделении подозре­ния на инфекционное заболевание животные подвергаются бактериологическому обследованию. При подтверждении ин­фекции вся поступившая партия животных уничтожается.

При возникновении массовых заболеваний среди живот­ных, находящихся в карантине, или при обнаружении в пе­риод экспериментов отдельных случаев инфекционных за­болеваний, особо опасных для лабораторных животных, в ви­варии проводится необходимый комплекс профилактических мероприятий. В этих случаях опыты на животных временно прекращаются.

Правила содержания экспериментальных животных в ви­варии.

По истечении карантинного срока животных перево­дят в экспериментальную секцию. Мышей, крыс, морских сви­нок и кроликов содержат в клетках, установленных на ме­таллических стеллажах. Грызуны содержатся в клетках со сплошным дном на подстилке или с сетчатым дном-полом. Подстилочным материалом могут служить древесные опил­ки, стружка, волокнистый торф, мягкая солома. Подстилки заранее автоклавируют или дезинфицируют в сухожаровой печи при температуре 150—180°С в течение 15—20 мин. При размещении животных по клеткам следует исходить из при­водимых ниже нормативов (табл. 6).

Примечание. Для примерного определения производственной площади сле­дует исходить из расчета, что 1 см площади дна клетки должен приходиться на 1 г массы животного. Стеллажи размещаются в основном вдоль стен и должны занимать примерно 0,4 м производственной площади.

В каждом отдельном помещении вивария рекомендуется содержать только один вид животных. Если по условиям эксперимента в одной секции совместно содержатся живот­ные разных видов, размещать их следует на разных стел­лажах. На каждой клетке с животными вывешивают паспор­та, образец которого приводится ниже.

Таблица 6.

Нормы площади для содержания лабораторных животных

Вид животных Минимальная площадь дна клетки на одно животное, см2 Максимально допустимое число живот­ных в клетке Число животных на 1 м2 пло­щади пола помещения; (взрослых / молодняка)
Мыши 65 / 240
Крысы 20 / 100
Морские свинки 15—18
Кролики 3—4

На клетках подопытных животных, которые могут явить­ся источником заражения человека, укрепляют паспорта яр­кого цвета. Животные, наиболее опасные в смысле возможности заражения окружающих, содержатся в изоляторе в ме­таллических клетках или стеклянных банках в металличе­ской оправе.

Отделение (лаборато­рия)

Клетка No,..

Вид, линия, пол живот­ных

Возраст... Дата поступления

(фамилия экспери­ментатора)

Начало эксперимента

Окончание экспери­мента

Особые отметки

Рис. 7. Образец этикетки (паспорта)

При уходе за животными, зараженными особо опасными инфекциями, персонал должен надевать два халата, резино­вый фартук, нарукавники, резиновые перчатки, маску и га­лоши.

В заразное помещение разрешается входить только рабо­чим, обслуживающим животных, и научно-техническим со­трудникам, участвующим в опыте.

Трупы животных, погибших в ходе эксперимента, до вскрытия хранятся в специальном холодильнике (не более суток). Вскрытие животных производится экспериментато­ром. В случае гибели животного вне зависимости от опыта на вскрытии присутствует представитель вивария. Каждый случай падежа или вынужденного забоя животных фикси­руется в специальном журнале по приводимой ниже форме.

Таблица 7.

Журнал регистрации павших или вынужденно забитых животных

Дата Вид жи­вотных Секция животных Предполагае­мый диагноз Результат вскрытия Кто произво­дил вскрытие Результат экспертизы
             

После вскрытия трупы заразных животных сжигают под. контролем ответственного лица, выделенного администраци­ей, трупы незараженных животных сдают утильзаводу в во­донепроницаемых металлических ящиках с обязательным оформлением соответствующей документации.

Работа по уходу и содержанию лабораторных животных строится в соответствии с распорядком дня и регламентом работы, утвержденным руководителем учреждения. В рас­порядке дня предусматривается время на санитарную обра­ботку помещения и оборудования, раздачу кормов и прове­дение экспериментальных работ и манипуляций.

Клетки для индивидуального содержания кроликов делают обычно деревянными, длиной 75 см, шириной 45—50 см и высотой 50—55 см, с ре­шетчатым полом, под которым должен быть железный приемник (противень). Переднюю стенку клетки обивают металлической сеткой с диаметром ячеек в 2—3 см.

Клетки для морских свинок такие же, как и для кроликов, но несколько меньших размеров (65´55´40 см). В клетках одноярусного содержания оби­вают сеткой снимающийся верх клетки, а при двухъярусном—одну из боко­вых стенок.

Клетки для белых мышей делают металлическими, размером 50´40´30 см, вставляемыми в противень, на дно которого насыпают мелкий, сухой торф или опилки. Стенки такой клетки—переднюю (дверка), одну боковую, верхнюю и дно—обтягивают мелкой сеткой. Внутри клетки помещается сет­чатое гнездо. При очистке клетку поднимают, и все нечистоты через сетку попадают в противень. Для мышей можно применять деревянные клетки того же размера, что и металлические, с сетчатыми передней (дверка) и верх­ней стенками.

Белых мышей помещают в клетки группами, из расчета 6‑8 самок и 1 самец, а для крыс—2‑4 самки и 1 самец в каждой. Клетки должны иметь затемненное отделение для устройства гнезда и отдыха белых мы­шей и крыс.

Клетки располагают на стеллажах, рядами, в один или 2—3 яруса, на расстоянии 40—50 см от пола и стен в целях защиты животных от диких грызунов (крыс, хорьков). Клетки нужно регулярно, не реже одного раза в три дня, очищать и мыть горячей водой. После такой обработки клетки высушивают огнем паяльной лампы, а в летнее время—на солнце. В сырые клетки помещать животных нельзя. Нечистоты из питомника следует удалять немедленно после уборки в специально определенное для этой цели место.

Некоторые общие сведения о лабораторных животных мы приводим в виде таблицы 8.

Таблица 8.

Общие сведения о лабораторных животных

  Собака Кошка Кролик Морская свинка Крыса Мышь Курица Голубь Лягушка
Продолжитель­ность жизни (в годах) 15-20 10-12 4-9 6-8 2-2,5 1,5-2 10-14 6-7
Продолжитель­ность бере­менности (в днях) 60-63 60-68 20-30 20-25  
Количество детенышей 1-10 3-6 3-5-15 1-6 5-9 5-9      
Количество по­метов в год 2-3 3-5 3-5 4-7 4-7      
Продолжитель­ность лакта­ционного пе­риода у са­мок (в днях) 30-40 30-40 30-50 25-35      
Время удвое­ния веса те­ла новорожденных (в днях)          
Время отделе­ния от мате­ри детены­шей (в неделях возраста) 6-8 6-8 3-5 2,5-3 3-4      
То же, самцов от самок (в месяцах)     1-1,5 1-1,5      
Отношение ко­личества сам­цов и самок в питомнике     1:10-12 1:5-10 1:1-4 1:5-8      
Возраст, в ко­тором мож­но проводить первую случ­ку (в месяцах) 6-8 6-10 4-6 3,5-4 2,5-3      
Предел производительности самцов (в годах)     2-2,5 2,5-3 1-2 1-1,5      
Температура тела 37,5-39° 38-39° 38,5-39,5° 38-39° 38,5-39,3° 37-39° 40,5-42° 41-43°  
Количество ударов серд­ца (в минуту) 70-150 120-140 120-150 130-790   520-780
Количество крови (отношение к ве­су тела) 1:14,5 1:5 1:18 1:17 1:13   1:11 1:10 1:15
Число дыха­тельных движений (в минуту) 14-24 20-30 50-60 100-150 »30   40-50 50-70  
Page 8

Наиболее распространенными заразными заболеваниями лабораторных животных являются пастереллез, паратиф (сальмонеллез), туляремия, инфекционная пневмония, псевдотуберкулез и кок­цидиоз.

Пастереллез. Заболевают кролики, морские свинки, мыши и крысы. Свинки болеют чаще в острой форме, а остальные виды—преимущественно в подострой или хронической форме.

Клиника при острой форме: слабость, повышение темпе­ратуры, нервные явления, понос. Смерть обычно через 12—48 часов. В скрытие: кровоизлияния (часто точечные) во всех паренхиматозных органах и на слизистой оболочке гортани и трахеи.

При подострой и хронической форме: учащенное, затрудненное, свистящее дыхание, насморк, кашель, чихание. Болезнь затягивается до двух и более недель. Вскрытие: катаральный или гнойно-катаральный ринит, бронхопневмония (иногда крупозная), серозно-фибринозный плеврит.

Диагноз подтверждается бактериологическим исследованием. Меры борьбы—на основании существующей инструкции МСХ СССР. Профилактика: выделение бактерионосителей и проведение санитарных мероприятий.

Паратиф поражает чаще всего крыс и мышей, но возможна передача инфекции морским свинкам и кроликам. Возбудитель—представитель груп­пы паратифов. Главные разносчики инфекции—животные-бактерионосители. Заболевание протекает в виде септицемии (острая форма) с клиникой поноса (фекальные массы желтовато-зеленоватого цвета), отказа от корма и общего угнетения. Смерть наступает обычно через 24—48 часов. При хроническом течении клинические признаки выражены неясно: апатия, уменьшение аппе­тита, взъерошенность шерсти, понос, у самок часто аборты.

Картина вскрытия при острой форме—увеличение селезенки и мезентериальных лимфатических узлов; слизистая кишечника воспалена, с наличием кровоизлияний и мелких просовидных узелков; при хрониче­ской форме изменения те же, содержимое кишечника слизистое, пенистое, желтоватого цвета. Диагноз устанавливают бактериологическим исследованием.

Профилактика: выявление бактерионосителей путем реакции агглю­тинации (титр 1:200 и выше считается положительной реакцией); ка­рантин в течение 20 суток для вновь поступающих животных, соблюдение зоогигиенических и ветеринарно-санитарных правил.

Туляремия. Заболевают крысы, мыши, реже кролики и морские свинки. При вскрытии обнаруживается увеличение лимфа­тических желез и селезенки с образованием некротических узелков. Такие же изменения находят в печени и в легких, а также подкожные гнойники (осо­бенно у кроликов). Для постановки диагноза необходимо бактериологическое исследование. Профилактика: приобретение животных из заведомо благополучных хозяйств, обязательный карантин при поступлении живот­ных, периодические ветеринарные осмотры. Больных животных немедленно убивают. Дезинфекция.

Инфекционная пневмония чаще всего поражает морских свинок. Воз­будитель—часто диплококк, иногда другие виды микроорганизмов. Пред­располагающие факторы: скученность, простуда, сырость поме­щений, отсутствие вентиляции, недостаточность питания, авитаминоз (А и С), бациллоносительство. Клиника: истечение из носовых отверстий, кашель, затрудненное дыхание, хрипы, лихорадка, апатия, истощение, у самок часто аборты. Патолого- анатомическая картина: очаговая гепатизация легких («мраморность»), в грудной полости значитель­ное количество мутного, с примесью фибрина, экссудата, воспаление верх­них дыхательных путей и плевры, увеличение селезенки. При постановке диагноза следует иметь в виду также пневмонии инвазионного и грибкового происхождения. Лечение: подкожно—глюкоза (40%) с 4 мг аскорбиновой кислоты в дозе 0,5—1,5 г в течение 5—6 дней. При­менение антибиотиков, если возможно, и сульфаниламидных препаратов. Профи­лактика: общие зоогигиенические и ветеринарно-санитарные мероприя­тия, изоляция больных, дезинфекция.

Псевдотуберкулез. Чаще заболевают кролики и морские свинки. Возбудитель—палочка псевдотуберкулеза грызунов. Клиника не характер­на: угнетенное состояние, отказ от корма, постепенное исхудание, иногда опухание лимфатических узлов, поносы, параличи. Продолжительность заболевания от нескольких дней до 5—6 недель; смерть от истощения. Вскрытие: поражение паренхиматозных органов, кишечника, иногда мышц, в виде мелких узелков, имеющих лучистую форму серо-белого цвета. Увеличение лимфатических узлов, преимущественно, брюшной полости. Диагноз ставят на основании патолого-анатомической картины и ре­зультатов бактериологического исследования. Меры борьбы: убой больных животных, карантинирование подозреваемых в заражении, дезин­фекция.

Кокцидиоз. Чаще всего поражаются кролики. Различают кишечную, печеночную и смешанную формы. Заболевание протекает остро и хронически (последнее чаще у взрослых кроликов, острое—у молодняка). Заражение происходит через корм и воду, загрязненную фекалиями, содержащими зре­лые ооцисты кокцидий.

Кролики—постоянные носители и выделители кокцидий, которые, выде­ляясь в виде ооцист с калом, через 2—3 дня созревают и становятся способ­ными к заражению животных.

Клиника: при острой форме—истощение, вздутие живота, понос, кроликов—потеря аппетита, прогрессирующее исхудание, периодическое появление жидкого кала.

При вскрытии—катар слизистой кишечника или наличие в печени белых узелков величиной от булавочной головки до горошины. Диагноз—на основании микроскопического обнаружения ооцист кокцидий. Меры борьбы и профилактика: лечение, создание благоприятных условий содержания животных, сухость в клетках, полноценное кормление, ежедневная чистка клеток, инвентаря, периодическая их дезинфекция, биотер­мическое обезвреживание навоза.

Лабораторные животные могут поражаться спирохетозом (кролики), септикопиэмией, энтеротоксемией, листериозом, рядом глистных ин­вазий, грибками и накожными парази­тами (чесотка, парша, стригущий лишай и др.).

Для более детального ознакомления с затронутым вопросом отсылаем интересующихся к руководству «Содержание мелких лабораторных животных в вивариях».

Подготовка животных к заражению

Перед опытом животное клеймят, взвешивают, определяют, если нужно, его пол, возраст и измеряют температуру тела.

Клеймение кроликов и морских свинок производят при помощи готовых металлических бирок с номерами или наложением тавра татуировочными щипцами.

Металлические номерки имеют заостренные концы, которыми и прока­лывают ушную раковину животных с внутренней стороны; на выпуклой стороне уха концы номерков загибаются. Номерки можно приготовить своими силами из нарезанных кусочков мягкой жести.

Номер надписывают жидкостью, состоящей из смеси 5 частей насыщен­ного раствора медного купороса и 1 части крепкой соляной кислоты. Пишут на металле заостренной палочкой и тотчас же надпись высушивают фильтровальной бумагой.

Перед клеймением татуировочными щипцами ухо внутренней стороны протирают спиртом, накалывают щипцами соответствующий номер, а затем место прокола втирают тушь или спиртовой раствор копоти. В крайних случаях, при острых опытах, можно метить животных путем выстригания шерсти на различных участках тела.

Мышей и крыс метят надрезом ушей или же окрашиванием различных частей тела животного насыщенным раствором пикриновой кислоты (долго сохраняется) или 0,5% спиртовыми растворами анилиновых красок. Этих лабораторных животных можно нумеровать непосредственно во время опы­та, пользуясь для этой цели красками, дающими стойкое окрашивание, например насыщенным спиртовым раствором фуксина, насыщенным водным или спиртовым раствором пикриновой кислоты или насыщенным водным раствором перманганата калия. У подопытных животных окрашивают разные части тела. Одной краской, как правило, метят пер­вые 9 номеров. Сочетание двух различных красок позволяет пометить до 100 животных.

Ниже в качестве примера приводится одна из схем нумерации. Метки пикриновой кислоты соответствуют единицам, метки фуксином обозначают десятки. Окрашенные таким образом животные в зависимости от места рас­положения пятна и его окраски будут иметь следующие условные номера: левая передняя лапа—No1, левый бок—No2, левая задняя лапа—No3, голова—No4, спина—No5, область крестца—No6, правая передняя лапа—No7, правый бок—No8, правая задняя лапа—No9. Нанесение фук­сина на те же места (вместо пикриновой кислоты) будет означать соответ­ственно: 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90.

При комбинации двух красок может быть получен любой двузначный номер, например: лапа левая передняя (фуксин) + лапа левая передняя (пикриновая кислота)—No11, лапа правая задняя (фуксин) + лапа левая задняя (пикриновая кислота)—No93.

У птиц металлические номера (браслеты) надевают на одну из ножек.

Взвешивание животных производят, смотря по их величине, или в ящике на обычных столовых весах (Беранже), или на весах для взвешивания новорожденных детей (по Метелкину). Мелких животных, например, мышей, взвешивают на ручных (аптекарских) весах с роговыми чашками.

Определение пола. Общие признаки: самцы крупнее самок по величине и грубее по конституции; передняя часть туловища самцов развита сильнее задней.

Для определения пола у кроликов захватывают их левой рукой за кожу в области шеи вместе с ушами, а другой рукой, оттянув хвост, натягивают свободными пальцами кожу у полового отверстия: у самок обнаруживается щель, сужающаяся к спине, а у самцов открывается круглое отверстие с выступающим из него половым членом. Таким же образом определяют пол у морских свинок. У самцов мышей и крыс расстояние между заднепро­ходным отверстием и половым значительно длиннее, чем у самок; кроме того, у последних хорошо заметны грудные соски.

Определение возраста у лабораторных животных при отсутствии соот­ветствующих записей довольно трудно. У старых животных редкий, без глян­ца шерстный покров, длинные когти, тусклый взгляд и темный напет на зу­бах. Приблизительное определение возраста у нормально упитанных, здоро­вых животных возможно по их живому весу.

Измерение температуры тела у лабораторных животных производится обычным максимальным термометром перед постановкой опыта, а иногда и во время нахождения животного под опытом. Колебания нормальной тем­пературы тела у животных зависят от многих причин: глубины введения термометра в прямую кишку, времени года, суток, пищевого режима и т. д. Нормальной глубиной для введения термометра принято считать 3,5 см. (удобно надевать на определенной высоте термометра резиновое колечко). Установлено, что на глубине 3 см температура тела у морских свинок равна 37,6°, на глубине 4 см 38,3°, а при 7,5 см 39,4°. Для установления нормы рекомендуют предварительное измерение температуры у животных до поста­новки опыта. Измерение температуры тела у животного следует производить постоянно в одни и те же часы, одним термометром, вводя его на одну и ту же глубину.

Термометр перед введением в прямую кишку дезинфицируется спиртом, вытирается досуха, а затем смазывается (вводимый его конец) вазелином.

Морских свинок для измерения температуры помещают в горизонталь­ное положение на ладонь согнутой в локтевом сгибе левой руки, нажимая большим пальцем на паховую область. Пальцем другой руки производят поглаживание (несколько раз) по шерсти от шеи до симфиза. Спустя несколько секунд морская свинка остается лежать совершенно неподвижно. Термометр вводят в прямую кишку сначала почти вертикально, а затем параллельно линией оси тела животного. Замечают время и следят за столбиком ртути.

Кроликов помещают на колени, охватывают левой рукой с упором головы животного в локтевой сгиб и той же рукой захватывают и поднимают хвост; правой рукой вводят термометр. Или же кролика завертывают в кусок какого-либо плотного материала («пеленают»), подтягивая конечности под живот. Показатели нормальной температуры у лабораторных животных приведены выше, в таблице 8.

Подготовка материала и инструментов для заражения. Материалом для заражения лабораторных животных в повседневной практике диагностических лабораторий обычно служат эмульсии, приготовленные из различных органов и тканей присланного для исследования материала. Кроме того, материалом для заражения могут быть различные истечения, мокрота, кровь, отделения ран, язв и т. п., полученные от больных. Эмульсии из органов (тканей) обычно готовятся на физиологическом растворе, примерно в соотношении 1 : 10. Для этой цели берутся небольшие кусочки из наиболее пораженных участков и растираются с физиологическим раствором в стерильной ступке до получения равномерной взвеси. Послед­няя вводится непосредственно животным или же предварительно фильтрует­ся в простерилизованную посуду через марлю (вату). При наличии трудно растираемого материала добавляют прокаленный песок, и после получения эмульсии фильтруют ее через марлю.

Бактериальную культуру готовят для заражения согласно схеме опыта или инструкции по выделению определенного микроорганизма, что указано в схеме по диагностике диагностики инфекционной болезни. Кроме материала для заражения, следует подготовить белую вату, спирт, заготовить этикетки на клетки подопытных животных, а также заранее простерилизованные ма­ленькие пакетики с ватой и т.д. На этикетках для клеток (банок) указывается фамилия ответственного за данный опыт сотрудника, дата, количество и вид животных, чем привиты, метод прививки и вводимая доза.

Подготовка шприцов к заражению. Для обеспечения безопасности при заражении животных разработаны специальные методические приёмы, включающие в себя:

· Подготовку шприцов для заражения,

· Наполнение шприцов заразным материалом,

· Заражение животных,

· Разборка шприцов после заражения,

· Обеззараживание.

Шприцы должны отвечать следующим требованиям: поршень должен плотно входить в цилиндр, не выпадать из него, свободно двигаться в нём, не пропускать набранную для контроля воду за поршень, цилиндр не должен иметь трещин.

При сборке шприца после проверки иглы на проходимость, определяют притёртость иглы к канюле цилиндра – шприц насухо вытирают стерильным ватным тампоном, наполняют через иглу водой из стерилизатора, воду под большим давлением выпускают и проверяют место насадки иглы – отсутствие капель в этом месте свидетельствует о правельной сборке шприца, плотной притёртости иглы к канюле и пригодности его к работе с инфекционным материалом. Наполнение шприца инфекционным материалом проводят над ёмкостью с дезраствором. При наполнении шприца следует избегать попадания в него пузырьков воздуха. Пузырьки воздуха из шприца с инфекционным материалом удалять категорически запрещается. Вводить животным материал с пузырьками воздуха не рекомендуется, т.к. это может повлечет за собой образование капель при извлечение иглы после заражения. В этом случае инфекционный материал следует выпустить в тампон погружённый в дезраствор, шприц разобрать и поместить в ёмкость для кипячения. Для дальнейшего заражения использовать запасной шприц. Шприц с инфекционным материалом следует держать над ёмкостью с дез. раствором горизонтально между указательным и средним пальцем снизу и большим пальцем сверху, не касаясь поршня.

Разборка шприца после заражения проводится над ёмкостью предназначенной для кипячения последних. Для предотвращения разбрызгивания при разборке, шприц должен быть опущен в ёмкость иглой вниз. Осторожно пинцетом последовательно снимается и опускается игла, поршень и цилиндр. Пинцет после разборки опускают в стакан со спиртом. При наличии в шприце остатков инфекционного материала его перед разборкой шприца выпускают в тампон, погружённый в дез. раствор.

Инструменты тотчас после окончания инъекции разбираются (шприцы) и вновь кипятятся 10 минут и больше (в зависимости от прививочного мате­риала). Инструменты после кипячения вытирают досуха и хранят в короб­ках в шкафу. Иглы после кипячения необходимо тщательно продуть, затем вставить мандрен, т. е. нержавеющую латунную проволочку. Стальные иглы (с мандренами), в целях предохранения их от ржавчины, можно хранить также в насыщенном на холоду и профильтрованном растворе буры или же в жид­кости следующего состава: карболовой кислоты (жидкой) 0,3 мл + соды двууглекислой 1,5 г + формалина 2 мл + дистиллированной воды 100 мл.

Page 9

Фиксация животных. При заражении лабораторных животных приме­няют различные, в зависимости от вида животных и метода введения мате­риала, способы фиксации. Для этой цели предложено довольно большое ко­личество всякого рода станков, досок-фиксаторов и т.п., но в обычной диа­гностической работе вполне можно обойтись без подобных приспособлений. Исключение составляет только заражение кроликов в мозг или под твердую мозговую оболочку, когда необходим фиксирующий столик.

В обычных условиях фиксация животных производится следующим об­разом. Кроликов помещают на стол в левом боковом положении, головой вправо от оператора. В этот момент фиксируют кролика правой рукой за кожную складку на спине; левую же руку ладонью вверх подводят под жи­вот кролика, ближе к задним конечностям. Затем захватывают между ука­зательными средним пальцами левое бедро (возможно выше), а большой па­лец охватывает тело животного со стороны правого паха. Приподняв заднюю часть животного и, освобождая правую руку, подводят ее (ладонью вверх) под грудную клетку позади передних конечностей. Затем захватывают ука­зательным и средним пальцами выше локтя левую ногу, а большим пальцем охватывают грудь в области правой подмышки так, чтобы правая нога была вынесена вперед. После этого кролика снимают со стола и вытягивают во всю длину.

Для внутривенных инъекций удобнее всего завертывать («пеленать») кролика в кусок плотного материала, предварительно подогнув ему ноги под живот; голову кролика оставляют свободной. Животное при этих спосо­бах фиксации держит помощник. Для этой цели существуют также специаль­ные закрытые ящики (боксы) с отверстием только для головы.

Туловище кролика плотно зажимают между коленями или прижимают локтем левой руки, оставляя свободной для проведения необ­ходимых манипуляций голову животного, повернутую вправо.

Фиксация головы кролика. Для этого удобно пользоваться боксом (рис. 8), имеющим вид ящика с верх­ней выдвижной крышкой. Передняя стенка ящика состоит из двух частей: нижней, укрепленной неподвижно, и верхней выдвигающейся. Посередине передней стенки имеется круг­лое отверстие диаметром 5 см, состоящее из двух половин: одна половина вырезана на нижней, другая—на верхней вы­двигающейся части передней стенки. Через это отверстие выводят наружу и фиксируют голову кролика. В задней ча­сти ящика с внутренней стороны на обеих боковых стенках набито по нескольку вертикальных планок, между которыми находятся пазы. Вставляя вертикально фанерную дощечку в тот или иной паз, можно увеличивать или уменьшать дли­ну бокса.

Рис. II. Бокс для фиксации головы кролика.

Длина бокса 40 см, ширина 15 см, высота 15,5 см (высо­та нижней передней стенки 9 см, верхней—6,5 см). Фикса­ция кролика в боксе описанной конструкции осуществляется следующим образом. Выдвигают верхнюю крышку бокса и вынимают верхнюю половину передней стенки. В ящик са­жают кролика так, чтобы шея его проходила через выемку нижней половины передней стенки, после чего голову живот­ного фиксируют, опуская на нее верхнюю половину передней стенки. В один из пазов вдвигают фанерную дощечку; ограничивая тем самым возможность движений кролика в ящике, а затем закрывают верхнюю крышку, которая фикси­рует подвижную часть передней стенки.

Фиксация кролика и других лабораторных животных (морские свинки, крысы) в лежачем поло­жении на спине или животе. Для фиксации кроли­ков и других животных (морские свинки, крысы) в лежачем положении на спине или животе пользуются специальными станками. Наиболее просто устроенный станок представляет собой обычную доску на низких ножках, по размерам соот­ветствующую тому или другому виду животного. На ребрах боковых сторон доски имеется по 2 крючка или петли. У од­ного из узких краев находится приспособление для фикса­ции головы животного—головодержатель. Он представляет собой надеваемое на голову животного кольцо, соединенное со штативом. При помощи винтов высоту кольца на стойке штатива можно регулировать.

Животное кладут в удобном для опыта положении, спи­ной или животом кверху. Все 4 лапы продевают в петли, сделанные из бинта, которые затем плотно затягивают. Сво­бодные концы тесемок из бинта (в первую очередь от перед­них лап и во вторую—от задних) привязывают к крючкам или петлям доски. Фиксацию животного к станку производят с помощником.

Фиксация морской свинки руками. Морскую свинку брюшком кверху или наружу (Рис. 8) берут левой рукой так, чтобы II палец находился под шеей, а I и III паль­цы—под передними конечностями животного. Правой рукой свинку поглаживают по животу до тех пор, пока она не успокоится, и только после этого приступают к намеченной операции, придерживая задние лапы животного правой рукой.

Рис. 8. Фиксация морской свинки руками.

Фиксация крыс. Складку кожи в области затылка захватывают корнцангом, плотно прижимая голову живот­ного к поверхности стола. Другой рукой берут хвост крысы и, приподняв ее над поверхностью стола, держат в таком по­ложении, чтобы голова слегка оттягивалась корнцангом (Рис. 9).

Рис. 9. Фиксация крысы корнцангом.

Фиксация мышей. Мышь пускают по столу, придер­живая ее I и II пальцами правой руки за кончик хвоста. Когда, продвигаясь в каком-либо направлении, мышь натя­нет хвост, быстрым движением левой руки хватают ее за складку кожи в области затылка, ближе к ушам, чтобы она не могла поворачивать голову (Рис. 10, а). Подняв мышь над столом, по­мощник держит ее на весу одной рукой за хвост, другой—за складку кожи на затылке, несколько растягивая в поло­жении, удобном для экспериментатора.

Рис. 10. Фиксация мыши.

Работать с мышами можно и без помощника, фиксируя их левой рукой: I и II пальцами левой руки животное за­хватывают за складку кожи в области затылка, а остальны­ми 3 пальцами, прижав их к запястью, придерживают хвост и кожу в области крестца (Рис. 10, б). При таком способе фиксирования правой свободной рукой можно производить различные опе­рации.

Способы заражения

В зависимости от цели исследования пользуются различ­ными способами заражения: внутрикожным, подкожным, внутримышечным, внутрибрюшинным, внутривенным, пероральным или интраназальным и др. При перечисленных способах, за исключением перорального и интраназального, заражение осуществляется с помощью шприца.

Взвесь микробной культуры, эмульсию из зараженных ор­ганов или кровь больного осторожно набирают в шприц, по­сле чего конец иглы закрывают кусочком ваты, смоченным 5% раствором хлорамина, 5% раствором карболовой кисло­ты или спиртом. Повернув шприц иглой кверху, осторожно выпускают из него пузырьки воздуха. Загрязненную вату бросают в банку с дезинфицирующим раствором.

Page 10

Заразить жи­вотное через рот можно двумя способами. Материал, предна­значенный для заражения, примешивают к корму или питью животного. Такой способ является наиболее простым и есте­ственным, однако, в лабораторной практике применение его ограничено, поскольку количество материала, попадающее в организм заражаемого животного, не подлежит точному уче­ту. Поэтому значительно чаще материал, предназначенный для заражения, вводят животному шприцем, игла которого имеет незначительный изгиб и утолщение на конце в виде оливы. Наличие изгиба допускает введение иглы в пищевод животного. Диаметр иглы для мышей должен быть не более 1 мм, для крыс—1,5 мм, длина—соответственно 35-45 и 70-75 мм.

Крыс и мышей фиксируют перед заражением в вертикаль­ном положении: одной рукой помощник держит животное за складку кожи на затылке, около ушей, другой—за корень хвоста. Животным открывают рот браншами пинцета, встав­ляя их между нижней и верхней челюстями. Иглу, введенную в рот, продвигают по задней стенке глотки на глубину 1 см у мышей и 2—2,5 см у крыс. На указанной глубине игле при­дают вертикальное положение. Процесс введения иглы, как правило, затруднений не представляет, конец ее проникает непосредственно в желудок или нижний отдел пищевода. Ко­личество материала, вводимого за один раз в желудок мы­шей, должно быть не более 1 мл, взрослым крысам — не бо­лее 3,5 мл (Рис. 11).

При пероральном введении жидкостей мелким лабораторным удобнее пользоваться полихлорвиниловой трубкой, представляющей собой наружную оболочку одного провода многожильного телефонного кабеля, из которого уда­лен проводник. Длина трубки 15—17 см, наружный диаметр 1—1,5 мм, такой эластический зонд при незначительном усилии легко проникает из полости рта в пищевод и желудок животного, не требуя строгого ограничения глубины введения, так как даже при излишне глубоком введении стенки желуд­ка не повреждаются.

Вводимая жидкость дозируется с помощью шприца, на со­сок которого надевают эластический зонд, внутренний просвет которого 0,5—0,7 мм.

Морских свинок и кроликов перед заражением per os фик­сируют в нормальном для животного положении. Удобнее всего завернуть их в полотенце и посадить к помощнику на колени.

Заразный материал вводят через эластический зонд. Для этой цели обычно выбирают катетер из наиболее мягкой и эластичной резины длиной 7,5—8 см и толщиной не более 0,3—0,5 см.

Рис. 11.

Перед введением зонда в рот животному вставляют роторасширитель или, как его называют, «зевник», который представляет собой дощечку с круглым отверстием в середине. Ширина дощечки для кролика равна 2 см, для мор­ской свинки —1 см. Через отверстие вставленного в рот «зевника» осторожно вводят в пищевод зонд, смазанный вазели­ном или глицерином. Для того чтобы облегчить введение зонда, животному вливают пипеткой в рот несколько капель воды, вызывая глотательные движения, во время которых зонд легко, без внешнего воздействия продвигается в глубь пищевода. Наружный конец введенного зонда присоединяют к шприцу, наполненному материалом, который вводят в же­лудок медленно в количестве 2,5—3,5 мл морским свинкам и 3,5—5 мл кроликам.

Заражение через дыхательные пути (интраназальное зара­жение)

Животному, фиксированному на доске, прикладыва­ют к носу кусочек ваты, смоченной эфиром или хлороформом. К заражению приступают после того, как у животного поя­вится состояние легкого наркоза. Зараженный материал с помощью шприца вводят в нос небольшими каплями на глубину 1—1,5 мм мышам, 2—3 мм крысам, 4 мм кроликам и морским свинкам. Чтобы не поранить слизистые оболочки, для введения материала берут абсолютно тупую иглу.

Заражение в переднюю камеру глаза (интраокулярный метод)

Произ­водится обычно у кроликов под местной анестезией глаза. Затем фиксируют глазное яблоко путем захватывания складки конъюнктивы (кнаружи от верхнего края роговицы) глазным пинцетом. После этого тонкой иглой, смоченной исследуемым материалом, про­тыкают роговицу у лимба в очень косом направлении и проникают в переднюю камеру глаза на глубину не менее 1 мм. Иглу тотчас же вынимают, а ранка закрывается сама по себе. При правильном введении иглы вытекания влаги из передней камеры быть не должно. Можно также после прокола роговицы продвинуть иглу в центральном направлении до тех пор, пока из просвета иглы не покажется жидкость. Выпустив несколько капель влаги передней камеры глаза, иглу соединяют со шприцем и вводят исследуемый материал (не более 0,05 мл).

Page 11

Небольшое количество крови получают у кроликов и мор­ских свинок из вен уха, у мышей и крыс—из вен хвоста, а большие количества — из сердца. В особых случаях прибега­ют к полному, или тотальному, обескровливанию, после кото­рого животное погибает.

Для пункции сердца животных фиксируют к доске брюш­ком кверху. Шерсть в области груди тщательно выстригают, кожу обрабатывают спиртовым раствором йода и после этого приступают к проколу, который в зависимости от вида жи­вотного имеет некоторые различия.

Пункция сердца кроликов. Определяют II пальцем, обра­ботанным спиртом и смазанным спиртовым раствором йода, сердечный толчок, т. е. точку наиболее сильно выраженной пульсации сердца. Обычно она прощупывается в третьем межреберье. Прокол грудной клетки делают в области сер­дечного толчка на расстоянии 2—4 мм от левого края гру­дины; иглу ведут в направлении к средней линии на глубину 2—2,5 см. При попадании иглы в полость сердца рука, в ко­торой находится шприц, начинает ощущать ритмичные толч­ки, связанные с пульсацией сердца и приподнимающие иглу. Поршень шприца легко выдвигается наружу и в цилиндре его тотчас появляется кровь. Взятие крови должно произво­диться по возможности быстрее во избежание ее свертыва­ния. По этой же причине шприц и иглу рекомендуется промы­вать перед опытом стерильным раствором цитрата или оксалата натрия. Взяв необходимое количество крови, быстрым движением, без рывка, вынимают иглу и на месте укола на­кладывают ватный тампон, пропитанный спиртовым раство­ром йода. Животному подкожно вводят подогретый до тем­пературы тела стерильный изотонический раствор хлорида натрия или глюкозу в количестве, равном двойному объему взятой крови. Пункцией сердца можно получить у кролика 25—30 мл крови.

Пункция сердца у морских свинок. Кончиками III—IV пальцев левой руки нащупывают сердечный толчок, в на­правлении которого вертикально на глубину 1,5—2 см вка­тывают иглу, отступя на 1—2 мм от левого края грудины. У морских свинок можно получить таким образом 10—12 мл крови.

Пункция сердца у крыс. Как и в предыдущих случаях, пальпаторно определяют место сердечного толчка. На 1 см выше от установленной точки и на 1—2 мм левее от края гру­дины делают прокол на глубину 1,5—2 см, держа иглу вер­тикально. Одномоментно у крыс можно получить 6—8 мл крови.

Тотальное обескровливание кролика. Вскрывают одну из сонных артерий, расположенных по обеим сторонам трахеи. Для получения стерильной крови руки оперируемого должны быть тщательно вымыты и обработаны спиртом или спирто­вым раствором йода, все инструменты предварительно необ­ходимо простерилизовать.

Подготовленного для кровопускания кролика привязывают станку брюшком кверху, фиксируя голову кольцом к штативу. Шерсть на шее тщательно выстригают, кожу дезинфи­цируют. К носу животного прикладывают кусочек ваты, смо­ченной эфиром. После того как наступит состояние наркоза, скальпелем делают разрез по средней линии шеи и разводят края раны пинцетом. Сонные артерии проходят по бокам тра­хеи в яремном желобке между веной и нервом. Сверху артерия прикрыта грудино-подъязычной и грудино-щитовидной мышцами. Поэтому для обнаружения нервно-сосудистого пучка эти мышцы разделяют тупым концом скальпеля или браншами пинцета. Артерию освобождают от окружающей соединительной ткани и подводят под нее две лигатуры. Ближай­шую к головке лигатуру завязывают двойным узлом, позади второй лигатуры на расстоянии 0,3—0,5 см накладывают пе­ан. Между лигатурой и пеаном маленькими остроконечными ножницами делают продольный разрез сосуда длиной не бо­лее 1,5—2 мм, вставляя в него канюлю (стеклянную трубочку с оттянутым капилляром, кончик которой скошен и хорошо оплавлен). Кончик вставленной канюли укрепляют второй лигатурой. После этого под резиновую трубку, надетую на расширенную часть канюли, подставляют пробирку или фла­кон и снимают пеан с артерии, чтобы кровь могла вытекать свободно. Обескровливание морских свинок про­изводят так же, как и кроликов.

Взятие крови из вены уха кролика. Для получения крови из краевой вены нужно прежде всего вызвать гиперемию уха, потирая его ладонями рук и слегка ударяя кончиками паль­цев. Затем вдоль наружного края уха удаляют пушок и про­тирают ватой, увлажненной 70% спиртом. Если в результате всех перечисленных процедур сосуды не инъецируются, ухо смазывают ксилолом или толуолом. После того как сосуды набухнут и четко обозначатся на поверхности ушной ракови­ны, наружную поверхность ее покрывают тонким слоем жид­кого парафина (во избежание быстрого свертывания крови) и делают прокол вены.

Для получения небольшого количества крови (менее 1 мл) прокалывают одну из небольших периферических ветвей, а для получения больших объемов крови (5—10 мл) вскрывают краевую вену уха. С этой целью иглу шприца вводят в вену почти параллельно поверхности уха, чтобы не повредить про­тивоположную стенку вены. При проколе вены иглой шприца кровь, как правило, выходит отдельными каплями с боль­шими интервалами и кровотечение прекращается быстро. Для того чтобы вызвать обильное кровотечение, нужно сде­лать ранку с рваными краями. С этой целью пользуются об­ломком тонкого капилляра пастеровской пипетки. При таком способе прокола из уха кролика получают до 30 мл крови. После взятия крови к проколу вены прикладывают на 2—3 мин кусочек сухой стерильной ваты, не нажимая сильно на стенку сосуда, так как при этом кровотечение может усилиться. Если кровотечение долго не прекращается, хорошие ре­зультаты дает нанесение на ранку нескольких капель пе­рекиси водорода.

Взятие крови из вен у морских свинок, крыс и мышей. У морских свинок кровь в количестве 0,3—0,5 мл получают после нанесения насечек на край уха или прокола мягких по­душек лапы.

У белых крыс и мышей для получения 1—3 капель кро­ви приходится прибегать к ампутации кончика хвоста пос­ле продолжительного прогревания его в воде температуры 45—50°С или протирания ксилолом. Взяв кровь, рану прижигают перекисью водорода.

Есть способ, позволяющий получить у крыс 0,5—1 мл крови из венозного сплетения, ле­жащего в орбите, позади глазного яблока. Взятие крови про­изводят стеклянной пипеткой с оттянутым капилляром (на­ружный диаметр 0,6 мл), острие которого сточено под уг­лом 45°.

Животное берут I и II пальцами левой руки со стороны спины за шею и слегка сдавливают с боков, вызывая легкое выпячивание глаз. Вращательным движением пипетки дела­ют прокол конъюнктивального мешка в медиальном углу гла­за между глазным яблоком и орбитой. После прокола пипет­ку ведут в направлении гортани на глубину 4—5 мм. Попа­дание в венозное сплетение сопровождается заполнением ка­пилляра пипетки кровью.

Получение дефибринированной крови. Кровь животного сливают в стерильную колбу со стеклянными бу­сами и непрерывно в течение 10—15 мин встряхивают. В ре­зультате встряхивания находящийся в крови фибрин выпада­ет в осадок, обволакивая бусы, а дефибринированная кровь, слитая в другую колбу или пробирку, утрачивает способ­ность свертываться.

Приготовление взвеси эритроцитов. Для ос­вобождения от пленок фибрина дефибринированную кровь фильтруют через трехслойный марлевый фильтр. Фильтрат наливают в центрифужные пробирки и центрифугируют при 2000—3000 об./мин. в течение 10—15 мин. Эритроциты оседают на дно пробирки, а прозрачная, слегка желтоватого цвета плазма образует надосадочный слой. После центрифугирова­ния уровень жидкости в пробирке отмечают карандашом, от­сасывают плазму пастеровской пипеткой, эритроциты промы­вают, доливая до метки стерильный изотонический раствор хлорида натрия, и вновь центрифугируют. Промывание эрит­роцитов с добавлением свежего раствора производят 2—3 разa, чтобы последняя порция промывной жидкости была бес­цветна.

Из промытых эритроцитов готовят 3% или 5% взвесь, прибавляя к 3—5 мл эритроцитов соответственно 97—95 мл изо­тонического раствора хлорида натрия (для получения мень­ших количеств взвеси объемы обоих ингредиентов уменьша­ют в одинаковое число раз).

Взвесь эритроцитов можно хранить в холодильнике при температуре 3—4°С в течение 5—6 дней.

Приготовление сыворотки крови. Кровь, со­бранную в стерильную пробирку, закрывают ватно-марлевой пробкой, ставят на 20—30 мин в термостат или водяную ба­ню, отрегулированную на 37°С, так как в тепле кровь свер­тывается быстрее и лучше. Во время свертывания сгусток крови обычно прилипает к стенкам пробирки. Поэтому после взятия пробирок из термостата сгусток отделяют от стенок пробирки круговым движением капилляра стерильной пасте­ровской пипетки или стеклянной стерильной палочкой.

После отделения сгустка сыворотку ставят в холодильник при температуре 3—4°С. В течение 3—4 ч сыворотка обычно отделяется полностью, и ее можно отсосать стерильной пасте­ровской пипеткой. Для того чтобы во время отсасывания со­держимое пробирки было хорошо видно, пастеровскую пи­петку соединяют со стеклянной трубкой — «мундштуком» (ре­зиновая трубка длиной 20—25 см). При отсасывании кончик пипетки не должен соприкасаться со сгустком крови, чтобы в сыворотку не попали эритроциты.

Окрашенную в розовый цвет сыворотку центрифугируют при 2000—3000 об./мин. в течение 10—15 мин для осаждения форменных элементов крови.

При взятии крови вскоре после кормления животных, а также при повторных кровопусканиях с короткими интерва­лами возникает иногда липемия, т. е. появление избытка жи­ровых веществ в крови. Сыворотки, получаемые во время липемии, бывают мутные (хилезные), иногда опалесцирующие, и это очень затрудняет чтение диагностических реакций, осо­бенно реакции преципитации. Во избежание получения мут­ных сывороток кровь у животных берут натощак. Просветле­ние липемической плазмы наступает также при введении в кровеносное русло животного гепарина, способствующего по­вышению концентрации в крови фермента, называемого фак­тором просветления. С этой целью кроликам весом 2—2,5 кг в краевую вену уха вводят за 1—1,5 ч до обескровливания 60 мг гепарина.

Форменные элементы из крови удаляют центрифугирова­нием. В слитой с осадка плазме через короткое время после центрифугирования образуется сгусток фибрина, который уп­лотняется при перемешивании крови стеклянной палочкой. Затем этот сгусток удаляют. В некоторых случаях фибрин из плазмы выпадает не полностью. Для удаления остатков фиб­рина и выявления полноты его удаления к сыворотке при­бавляют несколько капель тромбина. Освобожденную от фиб­рина сыворотку фильтруют через асбестовые фильтры. Полу­ченная таким способом сыворотка совершенно прозрачна и не имеет признаков опалесценции.

Приготовление цитратной крови. Полученную из сердца или вены кровь сливают в пробирку с 5% раство­ром цитрата натрия (10 мл крови, 1 мл цитрата натрия). Цитратная кровь не свертывается.

Приготовление плазмы крови. Цитратную кровь ставят на 18—20 ч в холодильник или подвергают центрифу­гированию. В результате над осадком эритроцитов образуется прозрачный слой жидкости желтоватого цвета—плазмы.

Page 12

В лабораторной практике приняты способы умерщвления, которые характеризуются простотой приемов и вызывают быструю, безболезненную смерть животного. Мышей, крыс, морских свинок по­мещают в стеклянную, плотно закрывающуюся банку с ку­сочком ваты, пропитанным хлороформом или эфиром. Жи­вотные засыпают и гибнут в течение 3—5 мин. Кроликов умерщвляют посредством воздушной эмболии. Для этого в краевую вену уха по направлению к его основанию вводят иглу шприца. Появление капельки крови свидетельствует о том, что игла находится в вене. После этого иглу соединяют с пу­стым 10-граммовым шприцем, поршень которого вытянут до конца. При надавливании на поршень в кровеносную систему животного поступает находящийся в цилиндре шприца дух, вызывая эмболию и быструю смерть.

Вскрытие животных

Трупы лабораторных животных вскрывают с целью выяснения причин гибели, выделения вве­денного возбудителя, выявления механизма распространения микробов в организме и места их локализации, изучения патологоанатомических изменений, наступающих в результате перенесенной инфекции. Вскрытие трупов животных произво­дят стерильными инструментами, соблюдая правила асеп­тики.

На столе должны находиться стакан, наполненный до по­ловины спиртом, стерильные ножницы, скальпель, анатомиче­ские и хирургические пинцеты, бактериальная петля, стериль­ные чашки Петри, пробирки и чашки с питательными среда­ми, стерильные пастеровские пипетки, предметные стекла, сте­рильный изотонический раствор хлорида натрия, банка с дез­инфицирующим раствором, ватные тампоны, спички и горелки (спиртовая и газовая). Вскрытие трупов следует производить таким образом, чтобы предупредить внесение микро­организмов с поверхности в глубину тканей, а также перенос микробов из одного органа в другой. С этой целью рекомен­дуется вскрывать животных в агональном состоянии, усыпив их эфиром, или тотчас после наступления смерти, так как в ближайшие часы после нее проницаемость тканей нарушается и бактерии из одного органа могут проникнуть в другой. Особую опасность в этом отношении представляет кишечник, со­держимое которого изобилует микробами.

Труп животного брюшком кверху кладут на деревянную доску или лоток с пластинкой застывшего парафина, растяги­вают пинцетом все 4 лапы и в таком положении фиксируют их булавками или небольшими острыми гвоздиками к по­верхности дерева или парафина. Грудь и брюшко протирают ватой, смоченной 5% раствором карболовой кислоты или 5% раствором хлорамина, или, лучше, смачивают спиртом и поджигают шерсть, чтобы содержащиеся на ней микробы, в том числе спороносные палочки, не разлетались и не загрязняли стерильные инструменты и органы вскрытия трупа. В процес­се вскрытия придерживаются общепринятого порядка. Сна­чала исследуют наружные покровы и подкожную клетчатку, затем проводят вскрытие, исследование и взятие материала из органов грудной полости, а в последнюю очередь вскрытие, исследование и взятие материала из органов брюшной по­лости.

Обработанную кожу разрезают по средней линии живо­та протяженностью от симфиза до грудино-ключичного со­членения. На уровне передних и задних лап делают боковые надрезы. Кожные лоскуты отпрепаровывают от подкожной клетчатки и отворачивают в стороны, прикалывая булавками к доске.

В протоколе вскрытия отмечают состояние подкожной клетчатки и лимфатических узлов в паху и подмышечных впадинах. Подкожная клетчатка может быть развита сильно, слабо или умеренно. Подмышечные и паховые узлы обнару­живаются легко. При осмотре узлов обращают внимание на их величину, форму и цвет. Для бактериологического иссле­дования лимфатические узлы раздавливают стерильным пин­цетом и погружают в жидкую питательную среду или втира­ют в поверхность плотной питательной среды.

Сменив или простерилизовав использованные для вскры­тия кожных покровов инструменты, приступают к вскрытию грудной клетки. Грудину, захваченную пинцетом, слегка при­поднимают, делают под ней небольшой надрез, вводят в него браншу ножниц и перерезают ребра вначале с одной, а за­тем с другой стороны. Если в грудной полости есть экссудат, из него делают мазки и посев. Вновь сменив ножницы или протерев их ватой, смоченной спиртом, разрезают перикард, обнажая поверхность сердца. Накаливают на пламени го­релки бранши пинцета или скальпель, прижигают поверх­ность сердца, затем стерильным пинцетом оттягивают кверху ушко правого предсердия и после этого через прижженное место вводят в полость желудочка или предсердия капилляр пастеровской пипетки. Кровь, поднявшуюся по капилляру пи­петки, засевают в питательную среду.

Далее приступают к осмотру органов, расположенных в грудной полости, регистрируя в протоколе имеющиеся в них изменения, например наличие экссудата в полости плевры, абсцессы, гиперемию (багрово-красное окрашивание) или, на­оборот, ишемию (малокровие) в легких. Кусочки легкого с выявленными в нем изменениями вырезают для бактериоло­гического исследования.

После этого, сменив инструменты, переходят к исследова­нию органов брюшной полости. Передний листок брюшины вскрывают ножницами. При наличии экссудата в брюшной полости делают из него мазок и производят посев в пита­тельную среду. Затем осматривают печень, селезенку, почки, отмечая цвет, величину органов, характеризуя их консистен­цию (нормальная, дряблая, уплотненная, хрупкая) и имею­щиеся очаги поражения, например абсцессы.

При локализации инфекционного процесса в желудочно-кишечном тракте делают посев содержимого желудка и кишечника, набирая его в пастеровскую пипетку через приж­женную желудочную и кишечную стенки. Таким же образом для посева берут экссудат, содержимое абсцессов, желчного и мочевого пузыря.

Из паренхиматозных органов (печень, почки, селезенка) взятие материала и засев его производят одним из следующих способов.

· У стерильной пастеровской пипетки обламывают кон­чик и проводят ее через пламя горелки. Затем капилляром пипетки прокалывают прижженный участок исследуемого ор­гана и насасывают в нее тканевую жидкость, которую засе­вают в питательную среду. Пипетки после использования опу­скают в банку с дезинфицирующим раствором.

· Прижженную поверхность органа надрезают стериль­ным скальпелем и из глубины надреза соскабливают бакте­риальной петлей небольшое количество материала, которое затем вносят в питательную среду.

· На прижженной поверхности органа делают надрез, остроконечными ножницами из глубины его вырезают ма­ленький кусочек, раздавливают между браншами пинцета и опускают в жидкую питательную среду или срезом ку­сочка делают отпечатки на поверхности плотной питательной среды.

Изменения, обнаруженные при вскрытии трупа, а также результаты бактериологического исследования вносят в про­токол вскрытия и бактериологического исследования трупного материала, составленный примерно по такому образцу:

1. Вид лабораторного животного, взятого в опыт.

2. Время заражения (месяц, число, час).

3. Материал, примененный для заражения (взвесь микро­бов с плотной питательной среды, бульонная культура, взвесь патологического материала и т. д.).

4. Время гибели животного (месяц, число, час).

5. Изменения, обнаруженные при вскрытии животного в месте введения заразного материала, состояние подкожной клетчатки, лимфатических узлов; изменения, найденные во внутренних органах.

6. Вид микроба, выделенного из трупного материала, его основные морфологические, культуральные, биохимические и серологические свойства.

После вскрытия трупы животных складывают в металличе­ские бачки с плотно закрывающимися крышками и засыпа­ют сухой хлорной известью. Трупы мелких лабораторных животных можно заливать раствором различных дезинфициру­ющих веществ: 5% раствором карболовой кислоты, 3—5% мыльно-карболовым раствором, 3—5% раствором хлорамина. Трупы животных, погибших от заражения споровыми форма­ми микробов, заливают хлорно-известковым молоком или 5—10% осветленным раствором хлорной извести. В дезинфици­рующем веществе трупы животных хранят до момента их сжигания.

Page 13

Вирулентность—биологическое свойство микроба, харак­теризующее степень его патогенности в момент исследования. В отличие от патогенности вирулентность является не видо­вым, а индивидуальным признаком микроба, который может усиливаться или ослабляться вплоть до полного исчезнове­ния под влиянием различных факторов внешней среды.

Для характеристики вирулентности пользуются количест­венными показателями, определяющими способность иссле­дуемой микробной культуры вызывать гибель искусственно зараженных ею подопытных животных. Изучение вирулент­ности бывает сопряжено с рядом трудностей, так как она оп­ределяется не только комплексом культурно-морфологиче­ских, токсигенных и биологических свойств микроба, но и резистентностью микроорганизма, подверженной большим колебаниям в связи с видом, возрастом животных, режимом их питания, температурой внешней среды, а также способом заражения, принятым в опыте. Поэтому при установлении ви­рулентности микроба очень важно вести исследование, точно соблюдая стандартность всех условий опыта.

Для определения вирулентности микробных культур чаще всего используют белых мышей. В том случае, когда белые мыши невосприимчивы к исследуемому возбудителю заболева­ния, пользуются другими видами животных: крысами, морс­кими свинками или кроликами.

Для определения вирулентности применяют молодую культуру микроба, так как старые культуры содержат боль­шое количество мертвых клеток.

Культуру микроба для заражения выращивают на мясо-пептонном агаре или другой плотной питательной среде, так как бульон, представляя собой сложный белковый субстрат, небезразличен для животного организма и может извращать результаты опыта. Исследуемую культуру микроба, выра­щенную на скошенном мясо-пептонном агаре, смывают изото­ническим раствором хлорида натрия и стандартизуют по оптическому стандарту так, чтобы в 1 мл этого раствора содер­жалось определенное количество микробных тел. В зависимо­сти от вида культуры, патогенности ее для животных, взятых в опыт, а также от цели и задач исследования количест­во микробных тел, содержащееся в 1 мл взвеси, может коле­баться от единиц до миллиардов. В тех случаях, когда по ка­ким-либо причинам получить агаровую культуру невозможно, пользуются суточной бульонной культурой. Для определения Dlm из бульонной культуры готовят ряд последовательных десятикратных разведений: 1:10, 1:100, 1:1000, 1:10000, 1:100000 и т.д.

Исследуемую взвесь бактерий вводят различными спосо­бами: внутривенно, внутрибрюшинно, внутримышечно, под­кожно, интраназально—в зависимости от целей и задач ис­следования.

Отстандартизованную взвесь микробов в изотоническом растворе хлорида натрия, а также разведения бульонной культуры готовят с таким расчетом, чтобы различные дозы микроба, используемые в опыте, содержались в одинаковых объемах жидкости.

Каждую дозу культуры вводят одновременно нескольким животным. При определении минимальной смертельной до­зы учитывают и отмечают в протоколе опыта следующие дан­ные:

· количество микробов, введенных в организм животного;

· способ их введения;

· масса тела зараженного животного;

· сроки гибели после заражения.

Степень вирулентности чаще всего характеризуют тремя следующими показателями:

1. Минимальная смертельная доза Dlm (Dosis letalis mi­nima), т.e. наименьшая доза микробов, которая при опреде­ленном способе заражения, в определенных условиях опы­та вызывает гибель около 95% подопытных животных.

2. Наименьшая безусловно смертельная доза Dll (Dosis lerie letalis) — наименьшая доза микробов, являющаяся смертельной для всех 100% животных, взятых в опыт.

3. Средняя смертельная доза микробов LD50 (Dosis leta­lis 50%)—доза микробов, вызывающая гибель 50% зара­женных животных.

Показатель LD50 позволяет получить более достоверные результаты, и потому он чаще других используется в практи­ке экспериментальных исследований.

В отличие от Dlm и Dll, определявшихся непосредственно по результатам опыта, LD50 вычисляется путем довольно сложных математических расчетов. Более прост метод Кербера, в котором простота расчета удачно сочетается с доста­точно высокой точностью получаемых результатов.

Page 14

В патологии человека большую роль играют токсигенные микроорганизмы, к которым относятся возбудители ботулизма, столбняка, газовой анаэробной инфекции, дифтерии, а так­же некоторые штаммы бактерий дизентерии Григорьева -Шига, стафилококка и стрептококка и некоторые другие.

Экзотоксины, вырабатываемые различными представите­лями этой группы микробов, обладают резко выраженной токсичностью, высокой избирательностью действия с пораже­нием отдельных органов и тканей и способностью при парен­теральном введении в организм вызывать образование анти­тел—антитоксинов, способных нейтрализовать соответствую­щие им экзотоксины.

Продуцируемые в процессе жизнедеятельности микроба экзотоксины легко диффундируют из клетки в окружающую их питательную среду. Бульонную культуру микроба выдер­живают в термостате в течение 2—3 недели для накопления в ней токсина, затем фильтруют через бактериальный фильтр. Получаемый при этом прозрачный фильтрат содержит неразведенный токсин.

Токсигенность микробов определяют по тому же принципу, что и вирулентность. Единицами измерения токсигенности, как и вирулентности, являются минимальная смертельная до­за (Dlm) и средняя смертельная доза (LD50).

Для определения Dlm и LD50 фильтрат бульонной культуры разводят стерильным изотоническим раствором хлорида натрия в сотни, тысячи и миллионы раз. Каж­дую дозу токсина испытывают одновременно на 6—10 жи­вотных. Для постановки проб подбирают животных, наибо­лее чувствительных к исследуемому токсину. Например, дифтерийный токсин титруют на морских свинках, столбнячный токсин—на мышах.

При учете полученных результатов в протоколе опыта от­мечают дозу введенного токсина, способ его введения, массу тела животного и время наступления его гибели после введе­ния токсина.

Литература

1. Аристовский В.М. др. Учебник медицинской микробиологии. —М., Медгиз, 1949.

2. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. Под ред. Биргера М.О., —М., «Медицина», 1982.

3. Лабинская А.С. Микробиология с техникой микробиологических исследований. —М., «Медицина», 1978.

4. Методы общей бактериологии в 3-х т. —М., «Мир», 1983.

5. Розанов Н.И. Микробиологическая диагностика заболеваний сельскохозяйственных животных. —М., ГИСХИ. 1952.

6. Сидоров М.А., Скородумов Д.И., Федоров В.Б. Определитель зоопатогенных микроорганизмов. —М., «Колос», 1995.

7. Тимаков В.Д., Гольдфарб Д.М. Основы экспериментальной медицинской бактериологии. —М., Медгиз, 1958.

Оглавление

Введение............................................................................................................................... 3

Бактериологическая лаборатория................................................................................ 3

Помещение бактериологической лаборатории и оборудование рабочего места 4

Правила работы и поведения в лаборатории....................................................... 7

Уборка лабораторного помещения..................................................................... 8

Мытье и обработка лабораторной посуды............................................................... 9

Дезинфекция...................................................................................................................... 14

Стерилизация.................................................................................................................... 15

Подготовка и стерилизация лабораторного оборудования........................... 15

Виды стерилизации.................................................................................................... 17

Микроскопические методы исследования............................................................... 23

Приготовление препаратов для микроскопирования живых микроорганизмов. 23

Приготовление мазков............................................................................................... 29

Окраска мазков............................................................................................................ 31

Простые методы окраски мазков....................................................................... 35

Окраска по Муромцеву.................................................................................... 35

Сложные (дифференциальные) методы окраски мазков............................. 36

Окраска по Граму.............................................................................................. 36

Видоизменения метода окраски по Граму...................................................... 39

Окраска по Граму в модификации Хукера................................................. 39

Окраска по Граму в модификации Берка.................................................... 41

Модификация по Синеву.................................................................................. 42

Модификация по Эткинсу................................................................................ 44

Окраска кислотоустойчивых микробов........................................................... 45

Окраска по Циль-Нильсену............................................................................. 45

Метод Труанта окрашивания на кислотоустойчивость......................... 46

Метод Гонзеля.................................................................................................... 47

Метод Бунге и Траутенрота........................................................................... 48

Окраска по Вейксельбауму (на спиртоустойчивость)............................ 48

Окраска по Грам-Муху (на грамофильную зернистость)...................... 49

Способ Нейссера................................................................................................ 49

Метод Пью (окраска метахроматических зерен)...................................... 50

Окраска по Романовскому-Гимза.................................................................. 51

Окраска капсул....................................................................................................... 52

Метод окраски капсул по Дюгиду................................................................ 52

Метод окраски капсул по Гиссу.................................................................... 52

Метод окраски капсул по Антони................................................................. 53

Способ Михина.................................................................................................. 53

Способ Гисса....................................................................................................... 53

Способ Ольта...................................................................................................... 53

Способ Ребигера................................................................................................. 54

Способ Гусельниковой (1949)........................................................................ 54

Способ Кауфмана.............................................................................................. 55

Способ Ионе........................................................................................................ 55

Окраска спор............................................................................................................ 55

Метод окрашивания эндоспор по Дорнеру................................................ 56

Метод окраски эндоспор по Шефферу -Фултону..................................... 57

Метод Виртца в модификации Саватеева.................................................. 58

Способ Пешкова (1924).................................................................................... 59

Способ Мюллера:.............................................................................................. 59

Способ Ауески.................................................................................................... 60

Способ Клейна:.................................................................................................. 60

Окраска жгутиков................................................................................................... 61

Метод окраски жгутиков по Грэю................................................................. 62

Метод окраски жгутиков по Ляйфсону........................................................ 63

Окраска жгутиков серебрением – модификация по Морозову............. 64

Способ Уварова.................................................................................................. 66

Способ Леффлера............................................................................................... 67

Способ Инуйе...................................................................................................... 67

Способ Бениньетти и Джино........................................................................... 68

Цитоплазматические включения........................................................................ 68

Окрашивание поли-b-оксимасляной кислоты............................................ 68

Окрашивание полифосфата............................................................................ 69

Окрашивание полисахаридов с использованием реактива Шиффа.... 69

Метод окраски полисахаридов алциановым синим................................ 70

Питательные среды......................................................................................................... 71

Техника посева микроорганизмов.............................................................................. 81

Техника посевов на плотные и жидкие питательные среды.................. 83

Получение чистых культур...................................................................................... 85

Посев штрихом.................................................................................................... 87

Получение чистой культуры методом рассева в глубине среды (по Коху) 88

Выделение чистой культуры по способу Дригальского......................... 88

Анаэростат для культивирования анаэробов............................................ 89

Методы, позволяющие изучить культуральные свойства микроорганизмов 89

Рост микробов на плотной питательной среде................................................... 89

Особенности микробного роста на жидких питательных средах................ 92

Рост на полужидкой питательной среде.............................................................. 93

Методы изучения биохимических свойств микроорганизмов............................ 94

Сахаролитические свойства микроорганизмов........................................ 94

Протеолитические свойства микроорганизмов......................................... 95

Определение индола в культуре микроорганизмов................................. 97

Определение сероводорода............................................................................ 98

Окислительно-восстановительные свойства микроорганизмов............... 98

Определение редуцирующей способности................................................. 99

Определение фермента каталазы.................................................................. 99

Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам.............. 100

Лабораторные животные............................................................................................ 102

Краткие сведения о содержании, разведении, кормлении и заболеваниях лабораторных животных 103

Правила пополнения вивария новыми животными................................ 105

Правила содержания экспериментальных животных в виварии....... 106

Уборка и дезинфекция вивария.................................................................... 111

Личная гигиена работников питомника (вивария)................................. 112

Правила кормления лабораторных животных....................................... 113

Заболевания лабораторных животных.............................................................. 115

Подготовка животных к заражению.................................................................... 117

Фиксация, методы заражения и взятия крови у лабораторных животных 122

Способы заражения............................................................................................. 126

Наркоз лабораторных животных............................................................... 127

Внутрикожный метод..................................................................................... 127

Подкожный способ заражения..................................................................... 127

Внутримышечный способ заражения........................................................ 128

Внутрибрюшинный способ заражения..................................................... 128

Внутривенное заражение кроликов............................................................ 129

Внутривенное заражение крыс и мышей.................................................. 129

Заражение через пищеварительный тракт............................................... 130

Заражение через дыхательные пути (интраназальное заражение).. 131

Заражение в переднюю камеру глаза (интраокулярный метод)........ 132

Внутримозговой метод (интрацеребральный)........................................ 132

Внутриплевральный метод........................................................................... 133

Содержание животных под опытом........................................................... 133

Взятие крови у лабораторных животных и ее обработка........................ 133

Умерщвление и вскрытие лабораторных животных.......................................... 138

Вскрытие животных................................................................................................. 138

Определение вирулентности микробов.................................................................. 142

Определение токсигенности микробов................................................................... 144

Литература..................................................................................................................... 145

МЕТОДЫ ОБЩЕЙ БАКТЕРИОЛОГИИ

Учебно-методическое пособие

Дмитрий Аркадьевич Васильев Сергей Николаевич Золотухин

Наталья Михайловна Никишина

Page 15

Механическое удерживание земляных масс на склоне обеспечивают контрфорсными сооружениями различных конструкций: ими могут быть подпорные стенки, свайные ряды, инъекционные преграды и простейший тип удерживающих сооружений — упорные призмы из грунта.

Подпорные стенки проектируют чаще всего для удержания неглубоких слоев, смещающихся по четко определенной поверхности скольжения (рис. 47). В зонах с ответственными зданиями и сооружениями подпорными стенками удерживают и более мощные слои, потенциальные поверхности скольжения которых известны. Как правило, подпорные стенки значительной высоты проектируют на участках автомобильных дорог, где с их помощью стабилизируют естественные и искусственные склоны.

Подпорные стенки делают из каменной кладки, бетона и бутобетона, железобетона, массивными или облегченными на свайном основании. В некоторых случаях при проектировании автомобильных дорог на склонах прибегают к устройству массивных стенок из армированного грунта или анкерных креплений. Сооружения врезают основанием в несмещающийся слой грунта и защищают от подземных и поверхностных вод.

Рис. 47. Удерживающие подпорные стены и свайные сооружения: а — массивная подпорная стена; б — то же, ниже подошвы склона; в — то же, в сочетании со шпунтовым рядом; г — консольная подпорная стена; д — то же, на контрфорсах; е — то же, в сочетании со сваями; ж — стена из армированного грунта; з — то же, монолитная заанкеренная; и — то же, из сборных панелей, заанкеренных в грунте; к — свайное поле из забивных свай; л — то же, из набивных; 1 — коренные породы; 2 — водовыпуск; 3 — плоскость скольжения; 4 — лоток; 5 — шпунтовый ряд; 6 — фильтрующая засыпка; 7 — поверхность естественного рельефа; 8 — контрфорс; 9 — сваи: 10 — арматура, заанкеренная в грунте; 11 — облицовка; 12 — железо­бетонная плита; 13 — анкер-свая с камуфлетной головкой; 14 — сваи-шпонки, в верхней части заполненные глиной

Параметры удерживающих сооружений определяют расчетом на опрокидывание и сдвиг. Выбор ответственных удерживающих сооружений и их конструктивное решение обосновывают технико-экономическими расчетами.

Подпорные стенки из армированного грунта представляют собой крупные массивы из слоев грунта, проложенных тонкими металлическими полосами, способными выдержать большие внешние нагрузки. Вертикальную боковую поверхность стенки укрепляют бетонными неармированными плитами, а в некоторых случаях — металлом. Это удерживающее гравитационное сооружение, которое поставлено на устойчивое основание. Такой контрфорс оказывает сопротивление возникающим в склоне сдвигающим силам и обладает достаточной прочностью на опрокидывание и скольжение по контакту (или с захватом основания) и на скол внутри удерживающего сооружения.

Подпорные стенки с анкерами позволяют передавать усилия, испытываемые стенкой со стороны обратной засыпки, на достаточно прочную породу, залегающую вне оползня, с помощью анкерных оттяжек. Эти оттяжки могут быть предварительно напряженными или постепенно напрягающимися в процессе эксплуатации сооружения. Их устраивают из тросов, штанг или проволоки, заделывая с помощью специальных устройств в коренной грунт.

Решение о применении анкеров должно быть подкреплено статическим расчетом, экономическим обоснованием и техническими возможностями производства работ.

Анкерирование??? как способ укрепления склонов связано с большими затратами, значительная доля которых приходится на предохранение анкеров от коррозии, поэтому использование этого крепления ограничивают такими случаями, когда другие средства крепления неосуществимы.

Конструкции типа свай или шпонок применяют, когда устройство упорных сооружений нецелесообразно по планировочным или другим соображениям. Обычно сваи и шпонки ставят при глубине ожидаемой поверхности смещения в пределах 1,5-2,0 м, если консистенция и структура грунта исключает его движение между сваями или шпонками. В этом случае их установка в сочетании с организацией поверхностного стока и дренажа экономически целесообразней, чем контрфорсы.

Сваи или шпонки располагают в плане в шахматном порядке и заглубляют в несмещающийся грунт на глубину не менее 2 м. Их погружают в предварительно прорезанные на склоне или у его подножья скважины. Сваи делают чаще всего из бетона или железобетона, а шпонки из гидравлической извести, иногда используют металлические сваи.

Любые свайные устройства требуют тщательных расчетов на опрокидывание и срез, с учетом реальных параметров сопротивления грунта сдвигу. Шпонки рассчитывают только на срез.

Page 16

Искусственное измерение рельефа склона следует предусматривать для предупреждения и стабилизации процессов сдвига, скольжения, выдавливания, обвалов, осыпей грунтов.

Образование рационального профиля склона (откоса) достигается приданием ему соответствующей крутизны и террасированием, отсыпкой в нижней части склона упорной призмы (контрбанкета).

Ширину (террас) и высоту уступов, а также расположение и форму банкетов следует определять расчетом общей и местной устойчивости склона (откоса), планировочными решениями, условиями производство работ и эксплуатационными требованиями.

На террасах необходимо предусматривать устройство водоотводов, а в местах высачивания подземных вод – дренажей.

Должен быть организован беспрепятственный сток поверхностных вод, исключено застаивание вод на бессточных участках и попадание на склон вод с присклоновой территории.

Устройство очистных сооружений в оползнеопасной зоне не допускается.

Для достижения требуемого понижения уровня подземных вод надлежит применять следующие виды водопонизительных устройств:

- траншейные дренажи (открытые траншеи и канавы);

- закрытые дренажи (траншеи, заполненные фильтрующим материалом) для осушения оползневого тела, рассчитанные, как правило, на недолговременный срок службы;

- трубчатые (в том числе мелкого заложения) и галерейные дренажи – в устойчивой зоне за пределами смещающихся грунтов для перехвата подземного потока при продолжительном сроке службы;

- пластовые дренажи на участках высачивания подземных вод на склонах (откосах);

- водопонизительные скважины различных типов в сочетании с дренажами или взамен их в случае большей эффективности или целесообразности их применения.

Дренирование подземных вод предусматривают для предохранения грунтов откоса от насыщения водой. Это мероприятие проводят как для действующих, так и недействующих оползней.

Обычно подземные воды дренируют одновременно на прилегающей территории и оползневом склоне.

Для перехвата подземных вод на прилегающей к склону территории устраивают дренажные сооружения, расположенные на безопасном расстоянии от зоны оползания. Тип и систему дренажных устройств проектируют в соответствии с гидрогеологическими условиями территории на основе требований, изложены ранее.

На оползневом склоне проектируют специфические дренажные сооружения, откосные прорези, наклонный дренаж, каптажные колодцы и наклонные скважины. В качестве простейших систем могут служить лотки и канавы глубиной до 3 м. Область их применения — это защита неглубоких оползней типа сплывин. Лотки используют также в качестве элементов выпуска подземных вод из слоев грунта, близких к поверхности склона.

Откосные дренажи применяют обычно для осушения откосов, потенциально подверженных поверхностным оползневым смещениям при неясно выраженных водоносных слоях или при многочисленных выходах подземных вод наружу в виде ключей. В конструктивном отношении они представляют собой сравнительно неглубокие траншеи, закладываемые ниже поверхности возможного оползания и заполненные дренирующим материалом (рис. 48, а). Их располагают поперек склона, а для наиболее полного перехвата грунтовых вод устраивают в виде призм разветвлениями различной формы на расстоянии друг от друга от 3 до 15 м в зависимости от характера и состояния осушаемых грунтов.

Рис. 48. Схемы дренажных устройств на оползневых склонах:

1 — коренные породы; 2 — поверхность скольжения; 3 — бровка откоса: 4 — дренажное устройство; 5 — лоток; 6 — колодцы; 7 — водоотводящие трубопроводы; 8 — грунт обратной засыпки; 9 — песок; 10 — гравий или щебень; 11 — бетонный лоток; 12 — дренажные скважины; 13 — депрессионная кривая; 14 — одерновка; 15 — утепляющий слой; 16 — контрфорс; 17 — дренажная труба; 18 — водонасыщенный грунт; 19 — каптажный колодец

Дренажные прорези устраивают при осушении толщи наносов на оползневых склонах, где другие типы дренажей, даже при незначительных подвижках, быстро выходят из строя. Их закладывают на бровке, отводя воду из насыщенного слоя (рис. 48, б). Для ее сброса дренажные прорези соединяют трубопроводами с нижним лотком или другими водоотводящимн сооружениями.

Прорези представляют собой траншею глубиной 6-12 м, заполненную дренирующим материалом и врезанную основанием в коренной грунт. Прорези защищают от засорения, укладывая поверх дренирующего материала дерн корнями кверху или соломенные маты и другие материалы, и забивают траншею глиной и грунтом.

Если водоносные горизонты имеют выход на склон, то их осушают горизонтальными или наклонными скважинами, заложенными со стороны склона (рис. 43, в) на отметках, близких к водоупору. Часть трубы перфорируют, превращая в фильтр. Механизм действия таких дрен заключается в следующем. При поступлении воды к откосу на участках, где заложены дрены, она постепенно поглощается перфорированной частью труб. В результате по мере приближения к откосу УГВ понижается, образуя сводчатую депрессионную кривую, имеющую общее падение вдоль дрен.

При фронтальном выклинивании водоносного горизонта на оползневом склоне применяют насланный дренаж, который укладывают на устойчивый откос на всю мощность водоносного горизонта. В конструктивном отношении он аналогичен пластовому и состоит из фильтра, дренажной трубы и утепляющего слоя, толщину которого назначают с учетом глубины промерзания грунтов (рис. 48, г).

Когда грунтовые воды выклиниваются на склоне в виде родников, проектируют бетонные или железобетонные каптажные колодцы, снабженные обратными фильтрами в местах выхода одиночных родников (рис. 48, б). Дренажные воды, как правило, отводят из колодца через трубчатый водосброс в ливневую канализацию.

Дренажные сооружения для стабилизации откосов в равной мере необходимы как на естественных склонах, так и при возведении искусственной насыпи, где оползневые смещения могут появиться в грунтах основания из-за чрезмерного напряжения от массы насыпи и гидростатического давления подземных вод, режим которых нарушен.

Устройства для перехвата и понижения подземных вод и предотвра­щения оползневых процессов выбирают на основе технико-экономического сопоставления. При этом рассматривают несколько вариантов различных дренажных сооружений, но сравнивают их и с другими методами защиты.

Page 17

На прибрежных склонах основной причиной развития оползневых процессов является подмыв водами рек естественных склонов или искусственных откосов и морская абразия береговых уступов. Поскольку активизация оползневых процессов и переработка берегов тесно связаны, то большая роль в комплексе противооползневых мероприятий принадлежит берегоукреплениям.

Берегоукрепление может быть выполнено в виде откосов, когда соответствующие одежды укладывают на предварительно спланированную поверхность, и набережных стенок (контрфорсов). Последние применяют, когда из-за нехватки свободного пространства на прибрежной территории осуществление других мероприятий осложняется или становится невозможным.

Берегоукрепления с точки зрения их влияния на режим водоемов относят к пассивным и проектируют в сочетании с активными, наносоудерживающими сооружениями: бунами и волнорезами. Буны являются одной из самых распространенных конструкций, стабилизирующих морской берег. Они представляют собой массивные сооружения, которые размещают перпендикулярно или под углом к береговой линии, заглубляя их основание в коренную породу (рис. 49).

Буны пересекают подвижную часть наносов и препятствуют их продольному транзиту. В результате наносы аккумулируются между бунами в приурезной части акватории и частично гасят энергию волны. Степень воздействия бун на водный поток и стабилизацию берегового склона существенно зависит от их взаимного размещения и длины. Параметры бун, как и других малых гидротехнических сооружений, активно влияющих на водный поток, рассчитывают по методике, описанной в литературе.

Рис. 49. Прибрежные противооползневые сооружения:

а — расположение бун в плане; б — поперечное сечение по бунам: в, г — незатопленный и затопленный волноломы (г — затопленный в сочетании с другими защитным мероприятиями);

1 — вертикальный фильтр; 2 — дренажная галерея; 3 — водоотводящая штольня: 4 — лоток: 5 — коренные породы; 6 — плоскость скольжения; 7 — подпорная стенка: 6 — искусственный пляж; 9 — затопленный волнолом

Область эффективного использования бун для борьбы с противооползневыми явлениями — это стабилизация надводных склонов и пляжей. Подводные склоны, особенно на большом протяжении, стабилизировать с их помощью не удается, так как склоны могут обрушиться в результате подвижки земляных масс.

Для стабилизации склонов поэтому нередко проектируют не только буны, но и волнорезы (волноломы). Их используют для защиты подводной части склона.

Волноломы делают как затопленного, так и незатопленного типа (рис. 49) из железобетонных массивов или оболочек, заполненных бетоном. Волноломы защищают от абразии берега путем частичного гашения волны и накопления наносов на тех участках акватории, где в подводной части склона имеют место оползни выдавливания.

Проблема борьбы с эрозией у подножья склона сводится к сохранению различными способами надежного упора в их нижней части и увеличению других удерживающих сил. В практике проектирования с этой целью используют, как правило, комплекс активных и пассивных защитных сооружений в сочетании с общими и специальными мероприятиями инженерной подготовки. Так, например, на побережье около Одессы создана из привозного материала полоса искусственных пляжей от Ланжерона до Аркадии протяженностью 5 км и шириной 40-50 м. Сохранение пляжей обеспечено комплексом гидротехнических сооружений: бун и волноломов. Для перехвата подземных вод запроектирована дренажная галерея на расстоянии 200 м от бровки обрыва с удалением грунтовых вод с помощью водоотводящей штольни.

Комплексное решение противооползневых мероприятий в Крыму предусматривает сочетание контрфорсных и берегоукрепительных сооружений, дренирование оползневых масс, разгрузку верхней части склона и уполаживание откосов с регулированием поверхностного стока.

Берегозащитные сооружения и мероприятия.Для инженерной защиты берегов рек, озер, морей, водохранилищ применяют следующие виды сооружений и мероприятий, приведенные в таблице 17.

Таблица 17

Вид сооружения и мероприятия Назначение сооружения и мероприятия и условия их применения
I Волнозащитные  
1 Вдольбереговые  
Подпорные береговые стены (набережные) волноотбойного профиля из монолитного и сборного бетона и железобетона, камня, ряжей, свай На морях, водохранилищах, озерах и реках для защиты зданий и сооружений I и II классов, автомобильных и железных дорог, ценных земельных угодий
Шпунтовые стенки железобетонные и металлические В основном на реках и водохранилищах
Ступенчатые крепления с укреплением основания террас На морях и водохранилищах при крутизне откосов более 15°
Массивные волноломы На морях и водохранилищах при стабильном уровне воды
2 Откосные  
Монолитные покрытия из бетона, асфальтобетона, асфальта На морях, водохранилищах, реках, откосах подпорных земляных сооружений при достаточной их статической устойчивости
Покрытия из сборных плит При волнах до 2,5 м
Покрытия из гибких тюфяков и сетчатых блоков, заполненных камнем На водохранилищах, реках, откосах земляных сооружений (при пологих откосах и невысоких волнах - менее 0,5-0,6 м)
Покрытия из синтетических материалов и вторичного сырья То же
II Волногасящие  
1 Вдольбереговые  
Проницаемые сооружения с пористой напорной гранью и волногасящими камерами На морях и водохранилищах
2 Откосные  
Наброска из камня На водохранилищах, реках, откосах земляных сооружений при отсутствии рекреационного использования
Наброска или укладка из фасонных блоков На морях и водохранилищах при отсутствии рекреационного использования
Искусственные свободные пляжи На морях и водохранилищах при пологих откосах (менее 10°) в условиях слабовыраженных вдольбереговых перемещений наносов и стабильном уровне воды
III Пляжеудерживающие  
1 Вдольбереговые  
Подводные банкеты из бетона, бетонных блоков, камня На морях и водохранилищах при небольшом волнении для закрепления пляжа
Загрузка инертными на локальных участках (каменные банкеты, песчаные примывы и т.п.) На водохранилищах при относительно пологих откосах
2 Поперечные  
Буны, молы, шпоры (гравитационные, свайные, из фасонных блоков и др.) На морях, водохранилищах, реках при создании и закреплении естественных и искусственных пляжей
IV Специальные  
1 Регулирующие  
Управление стоком рек (регулирование сброса, объединение водостоков в одно устье и др.) На морях для увеличения объема наносов, обход участков малой пропускной способности вдольберегового потока
Сооружения, имитирующие природные формы рельефа На водохранилищах для регулирования береговых процессов
Перебазирование запаса наносов (переброска вдоль побережья, использование подводных карьеров и т.д.) На морях и водохранилищах для регулирования баланса наносов
2 Струенаправляющие  
Струенаправляющие дамбы из каменной наброски На реках для защиты берегов рек и отклонения оси потока от размывания берега
Струенаправляющие дамбы из грунта На реках с невысокими скоростями течения для отклонения оси потока
Струенаправляющие массивные шпоры или полузапруды То же
3 Склоноукрепляющие  
Искусственное закрепление грунта откосов На водохранилищах, реках, откосах земляных сооружений при высоте волн до 0,5 м

Выбор вида берегозащитных сооружений и мероприятий или их комплекса следует производить в зависимости от назначения и режима использования защищаемого участка берега с учетом в необходимых случаях требований судоходства, лесосплава, водопользования и пр.

При выборе конструкций сооружений следует учитывать, кроме их назначения, наличие местных строительных материалов и возможные способы производства работ.

В состав комплекса морских берегозащитных сооружений и мероприятий при необходимости должно быть включено регулирование стока устьевых участков рек в целях изменения побережья или обеспечения его речными наносами.

Page 18

Кроме рассмотренных выше методов борьбы с оползневыми и обвальными явлениями также рассматриваются следующие мероприятия и сооружения инженерной защиты.

Удерживающие сооружения.Удерживающие сооружения следует предусматривать для предотвращения оползневых и обвальных процессов при невозможности или экономической нецелесообразности изменения рельефа склона (откоса).

Удерживающие сооружения применяют следующих видов:

- подпорные стены (на естественном или свайном основании);

- свайные конструкции и столбы – для закрепления неустойчивых участков склона;

- анкерные крепления – в качестве самостоятельного удерживающего сооружения (с опорными плитами, балками и т.д.) и в сочетании с подпорными стенами, сваями, столбами;

- поддерживающие стены – для укрепления нависающих скальных карнизов;

- контрфорсы – отдельные опоры, врезанные в устойчивые слои грунта, для подпирания отдельных скальных массивов;

- опояски (упорные пояса) – невысокие массивные сооружения для поддержания неустойчивых откосов;

- облицовочные стены – для предохранения грунтов от выветривания и осыпания;

- пломбы (заделка пустот, образовавшихся в результате вывалов на склонах) для предохранения скальных грунтов от выветривания и дальнейших разрушений;

- покровные сетки в сочетании с анкерными креплениями.

Для свайных конструкций следует предусматривать, как правило, буронабивные железобетонные сваи. Применение забивных свай допускается в случаях, когда проведение сваебойных работ не ухудшает условий устойчивости склона (откоса).

При наличии подземных вод следует предусматривать гидроизоляцию по верховой грани подпорных стен и устройство застенного дренажа с выводом вод за пределы подпираемого грунтового массива.

Улавливающие сооружения.Улавливающие сооружения и устройства (стены, сетки, валы, траншеи, надолбы) следует предусматривать для защиты объектов от воздействия осыпей, вывалов, падения отдельных скальных обломков.

Улавливающие стены и сетки располагают у подошвы склонов (откосов) крутизной 250 – 350 для защиты от воздействия осыпей, вывалов, падения отдельных скальных обломков и небольших обвалов.

Улавливающие траншеи и улавливающие полки следует размещать у подошвы обвалоопасных склонов (откосов) высотой до 60 м и крутизной 350 для защиты от вывалов отдельных обломков грунта объемом до 1 м 3, улавливающие валы – у подошвы обвалоопасных склонов большой протяженности.

Улавливающие стены, траншеи и валы допускается располагать на склонах на высоте не более 30 м над защищаемым объектом при крутизне склона не более 250.

Оградительные стены следует размещать у подошвы склонов (откосов) высотой до 30 м (соответственно 50 м) и крутизной 400 – 450 для улавливания мелких (до 0,01 м3) обломков скального грунта или задержания осыпающегося скального грунта.

Покровные свободно висящие сетки надлежит применять для защиты объектов, близко расположенных к подошве склона (откоса), от падающих скальных обломков.

Надолбы следует предусматривать на затяжных склонах высотой до 50-60 м и крутизной до 300 в комплексе с другими улавливающими сооружениями и устройствами для погашения скорости обломков скального грунта.

В проектах улавливающих сооружений и устройств следует предусматривать возможность подъезда транспортных средств и очистки улавливающих пазух от скопления продуктов выветривания, осыпей и обвалов в условиях эксплуатации.

Противообвальные галереи.Противообвальные галереи необходимо размещать на обвальных участках железных, автомобильных и пешеходных дорог для защиты от падающих обломков и глыб и рассчитывать на нагрузки и воздействия. На кровле противообвальных галерей необходимо устраивать амортизирующую грунтовую отсыпку, снижающую динамическое воздействие обвалов, предотвращающую повреждение конструкций и обеспечивающую скатывание обломков через галерею. В основании отсыпки необходимо укладывать гидроизоляцию, а также предусматривать отвод с кровли галерей поверхностных вод. Для отвода подземных вод, поступающий к галерее с верховой стороны, должен быть устроен продольный застенный дренаж.

Агролесомелиорация, защитные покрытия и закрепление грунтов.Мероприятия по агролесомелиорации следует предусматривать в комплексе с другими противооползневыми и противообвальными мероприятиями для увеличения устойчивости склонов (откосов) за счет укрепления грунта корневой системой, осушения грунта, предотвращения эрозии, уменьшения инфильтрации в грунт поверхностных вод, снижения воздействия выветривания.

Мероприятия по агролесомелиорации включает: посев многолетних трав, посадку деревьев и кустарников в сочетании с посевом многолетних трав или одерновкой.

Подбор растений, их размещение в плане, типы и схемы посадок следует назначать в соответствии с почвенно-климатическими условиями, особенностями рельефа и эксплуатации склона (откоса), а также с требованиями по планировке склона и охране окружающей среды.

Посев многолетних трав без других вспомогательных средств защиты допускается на склонах (откосах) крутизной до 350, а при большей крутизне (до 450) – с пропиткой грунта вяжущими материалами.

Для обеспечения устойчивости склонов (откосов) в слабых и трещиноватых грунтах допускается применять цементацию, смолизацию, силикатизацию, электромеханическое и термическое закрепление грунтов.

Для защиты обнаженных склонов (откосов) от выветривания, образования вывалов и осыпей допускается применять защитные покрытия из торкретбетона, набрызг-бетона и аэроцема (вспененного цементно-песчаного раствора), наносимые на предварительно навешанную и укрепленную анкерами сетку.

Для снижения инфильтрации поверхностных вод в грунт на горизонтальных и пологих поверхностях склонов (откосов) допускается применять покрытия из асфальтобетона и битумоминеральных смесей.

Противоселевые сооружения и мероприятия.Для инженерной защиты территорий, зданий и сооружений от селевых потоков применяют следующие виды сооружений и мероприятий, приведенныев таблице 9.

Таблица 9

Вид сооружения и мероприятия Назначение сооружения, мероприятия и условия их применения
I Селезадерживающие  
Плотины бетонные, железобетонные, из каменной кладки: водосбросные, сквозные. Плотины из грунтовых материалов (глухие) Задержание селевого потока в верхнем бьефе. Образование селехранилищ
II Селепропускные  
Каналы. Селеспуски Пропуск селевых потоков через объект или в обход него
III Селенаправляющие  
Направляющие и ограждающие дамбы. Шпоры Направление селевого потока в селепропускное сооружение
IV Стабилизирующие  
Каскады запруд. Подпорные стены. Дренажные устройства. Террасирование склонов. Агролесомелиорация Прекращение движения селевого потока или ослабление его динамических характеристик
V Селепредотвращающие  
Плотины для регулирования селеобразующего паводка. Водосбросы на озерных перемычках Предотвращение селеобразующих паводков
VI Организационно-технические Организация службы наблюдения и оповещения Прогноз образования селевых потоков

Противолавинные сооружения и мероприятия.Для инженернойзащиты территории, зданий и сооружений от снежных лавин применяют следующиевиды сооружений и мероприятий, приведенные в таблице 10.

Таблица 10

Вид сооружения и мероприятия Назначение сооружения и мероприятия и условия их применения
I Профилактические  
Организация службы наблюдения, прогноза и оповещения Прогноз схода лавин. Прекращение работ и доступ людей в лавиноопасны зоны на время схода лавин и эвакуация людей из опасной зоны
Искусственно регулируемый сброс лавин Регулируемый спуск лавин и разгрузка от неустойчивых масс снега путем обстрелов, взрывов, подпиливания карнизов и т.п. на основе прогноза устойчивости масс снега на склоне
II Лавинопредотвращаюшие  
Системы снегоудерживающих сооружений (заборы, стены, щиты, решетки, мосты), террасирование склонов, агролесомелиорация Обеспечение устойчивости снежного покрова в зонах зарождения лавин, в том числе в сочетании с террасированием и агролесомелиорацией, регулирование снегонакопления
Системы снегозадерживающих заборов и щитов Предотвращение накопления снега в зонах возникновения лавин путем снегозадержания на наветренных склонах и плато
Снеговыдувающие панели (дюзы), кольктафели Регулирование, перераспределение и закрепление снега в зоне зарождения лавин
III Лавинозащитные  
Направляющие сооружения: стенки, искусственные русла, лавинорезы, клинья Изменение направления движения лавины. Обтекание лавиной объекта
Тормозящие и останавливающие сооружения: надолбы, холмы, траншеи, дамбы, пазухи Торможение или остановка лавины
Пропускающие сооружения: галереи, навесы, эстакады Пропуск лавин над объектом или под ним

Выбор противолавинных комплексов сооружений и мероприятий следует производить с учетом режима и характеристик лавин и снегового покрова в зоне зарождения, морфологии лавиносбора, уровня ответственности защищаемых сооружений, их конструктивных и эксплуатационных особенностей.

Page 19

Овраги – продукт эрозии, т.е. размыва пород временными потоками воды, образующиеся в результате атмосферных осадков.

Проектом планировки территории оврагов отводятся, в основном, под зеленые насаждения. Отдельные отвершки, расположенные в районах капитальной застройки, промышленной зоны или под проектируемыми дорогами, засыпаются. Во избежание роста оврагов намечается тщательная организация поверхностного стока на прилегающих территориях, перехват дождевых и талых вод и организованный отвод их, минуя овраги, или сброс в овраги с устройством водосбросных сооружений. В тех случаях, когда трудно предотвратить поступление в овраги поверхностных вод с прилегающих территорий, отвод воды в тальвегах оврагов, во избержание их углубления и обрушения откосов, предусматривается по бетонным лоткам прямоугольного сечения шириной 1-1,5 м, глубиной до 1,0 м. В тех случаях, когда в овраги намечается сосредоточенный сброс поверхностных вод, по тальвегам возможно устройство запруд высотой 1-2 м из местных материалов. Запруды, снижая скорости течения, будут способствовать выпадению наносов и осветлению воды, а также обеспечат защиту дна от размыва. Для защиты склонов оврагов от размыва грунтовыми водами предусматривается каптаж выклинивающихся грунтовых вод и отвод воды в тальвег оврага по бетонным лоткам.

На отдельных незакрепленных участках склонов с большой крутизной намечается уполаживание откосов оврагов с заложением 1:2 и укрепление их одерновкой и посадками деревьев и кустарников. Для посадок по склону рекомендуется применять древесно-кустарниковые породы с широко развитой корневой системой, способной проникать на большую глубину.

В качестве профилактических мероприятий необходимо в оврагах применять организационные ограничения: запрещение вырубки леса, выпас скота.

Быстрее размываются глинистые грунты. Росту оврагов способствует: физические свойства грунтов, отсутствие растительности на водоразделах и склонах, неровности рельефа, наличие трещин в толще грунта, деятельность человека, большое количество выпадающих атмосферных осадков. Являются природной дренажной системой. Отрицательное воздействие: затрудняется планировочное решение города, происходит потеря ценных земель, сложность прокладки инженерных коммуникаций, затрудняется связь между отдельными частями города, необходимость возведения мостов и земляных дамб, разрушаются здания и сооружения в момент развития оврагов, чрезмерно осушаются приовражные территории, что отрицательно влияет на зеленые насаждения, ущерб городскому хозяйству. Верховье оврага – исток. Устье – место его впадения в водоем. Базис эрозии – глубина оврага, определяемая уровнем воды в водоеме. Лощина – долина с пологими склонами. Балка – лощина заросшая травой.

Виды оврагов: - донные: размыв идет по дну оврага; - береговые: размываются боковые склоны балок или рек.

По конфигурации:

- ствольные; - разветвленные: чаще два ствола с общим устьем; - древовидные: сложная конфигурация и большие площади.

По характеру процесса:

- действующие; - затухающие;

- засыпанные.

Мероприятия по защите от оврагов проводят в четыре стадии:

1 стадия: поверхностный водоотвод, заравнивание промоин, посадка трав (прекращение вырубки).

2 стадия: те же мероприятия, но в большем объеме, укрепление дна и устройство конструкции, задерживающих твердые фракции.

3 стадия: те же мероприятия, а так же устройство продольных плитневых оград с забивкой их землей, облесение склонов.

4 стадия: посев трав, кустарников и деревьев. Лесопосадки: расстояние от бровки оврага до лесополосы 4-5 м, ширина приовражной лесополосы 12-24 м, в вершинах оврага ширина лесополосы в 1,5 раза больше чем основная. Требования при выборе растений: развитая коревая система, неприхотливость и производительность, вегетативное размножение. В глубоких оврагах середину дна от 1,5 до 3 м следует оставлять не облесенной, верхние и средние части склонов сложны для посадок из-за отсутствия питательных веществ и чрезмерной сухости, специальные мероприятия для защиты лесопосадок.

Искусственные сооружения

Для борьбы с оврагами используются гидротехнические сооружения. Водозадерживающие сооружения: валы-каналы, террасы, валы-террасы. Их задача – задержание поверхностного стока. Водонаправляющие сооружения: водонаправляющие валы, валы-распылители, каналы-распылители. Их задача регулировать водные потоки, путем изменения их направления и распыления. Водосбросные: быстротоки, перепады и водосбросы. Водосбросы делятся на шахтные, трубчатые и консольные. Их задача обеспечить безопасный и организованный сброс вод на дно оврагов. Донные сооружения: донные запруды, донные перепады и пороги. Их задачи: уменьшение скоростей потока, повышение шероховатости русла, задержание продуктов выноса в пределах оврага, расширение дна оврага, прекращение дальнейшего размыва и углубление дна.

Page 20

Если глубина оврага более 5 м необходимо устройство берм. Засыпка или намыв. Наиболее эффективна засыпка на оврагах каньонного типа. Начинается засыпка с верховых участков, засыпают ярусами с послойным уплотнением. Обязательно по дну прокладывается водосборная труба (водосборный коллектор, а иногда дренажный коллектор, если нужно понизить УГВ на прилегающих территориях).

Организация поверхностного стока – устраивается во всех случаях. Эффективны головные дренажи.

Варианты использования оврагов для градостроительных целей: сохранение оврага и исключение территории из общей площади города, проведение мероприятий для стабилизации оврага и исключение территории, использование заовраженных территорий после проведения специальных мероприятий, использование территорий после проведения обычных мер по благоустройству; сооружение парков и садов, искусственные водоемы, устройство зданий и сооружений (после стабилизации и при крутизне склонов не более 200‰), городская магистраль.

Причины оврагообразования

С геологической точки зрения образование оврагов является следствием струйчатой эрозии, вызванной периодической деятельностью воды. Во время снеготаяния и обильных дождей потоки поверхностных вод постепенно образуют на склонах поверхности вытянутые промоины — овраги, называемые еще депрессиями рельефа.

Явление размыва поверхности зависит от многих факторов, в первую очередь от геологического строения территории и интенсивности выпадения осадков. Наиболее сильному размыву подвержены лёссовидные и глинистые грунты. Отсутствие растительности и расчлененный рельеф усугубляет разрушительную деятельность воды. В развитии оврагов могут участвовать и грунтовые воды, которые вскрываются при врезании дна и склонов оврага в толщу водоносных пород. Грунтовые воды способствуют нарушению устойчивости откосов в местах выхода их на поверхность и, суммируясь с потоком поверхностных вод, дальнейшему интенсивному росту оврага.

Овраги могут быть следствием хозяйственной деятельности человека. Бессистемная разработка грунта на склонах и у их подножья, неорганизованный сброс отработанной воды, утечки из канализационных и водопроводных сетей являются причинами оврагообразования.

Рис. 50. Схемы продольного и поперечных профилей оврага:

а, б, в — соответственно верхняя, средняя и устьевая части с уклонами

Рост оврага в длину ограничен водоразделом в его вершине и базисом эрозий в нижней части — отметкой дна, равной горизонту воды водоема в устье.

Продольный профиль дна оврага имеет неодинаковый уклон. Его величина уменьшается от вершины к устью (рис. 50). В верхней части дно оврага почти отвесно, а поперечное сечение представляет щель, расширяющуюся кверху. В средней части продольный уклон еще достаточно велик, а поперечное сечение имеет трапециевидную форму. В нижней части продольный уклон уменьшается по сравнению со средней частью, достигая минимальных величин в устье. Поперечное сечение на низовом участке сохраняет форму трапеции, боковые склоны уполаживаются и могут приближаться к устойчивому очертанию.

Параметры продольного и поперечного профиля зависят от стадии развития оврага. Затухшие, рост которых закончен, характерны стабильными размерами сечения и обычно покрыты растительностью. Повторная активизация роста такого оврага возможна только при понижении базиса эрозии.

Наиболее опасны для прилегающей территории действующие овраги, особенно с крутыми склонами, лишенными растительности. В этих случаях происходит нарушение устойчивости склонов оврага, которое проявляется в виде оползней, обвалов .

Причинами потери устойчивости крутых склонов являются внутренние или внешние силовые воздействия, вызывающие нарушение естественного равновесия откоса. Эти воздействия могут быть связаны с размещением вблизи склона зданий и сооружений, изменением гидродинамических сил фильтрационных потоков, уменьшением пассивного давления подошвы склона и другими факторами.

В плане овраги образуют различные формы, соответствующие топографии местности. Нередко они имеют многочисленные боковые ответвления—отвершки, представляющие собой овраги в начальной стадии развития.

Градостроительная оценка территорий с оврагами и задачи инженерной подготовки

Наличие оврагов на территории города характеризует территорию как неблагоприятную или особо неблагоприятную для градостроительных целей. Только при незначительном числе оврагов, малой глубине их (до 3 м) и пологих склонах, а также при полном исключении возможности развития и роста оврагов территория города может быть признана благоприятной для строительства и жизни города.

С градостроительной точки зрения наличие оврагов на территории города, развитие сети и рост отдельных оврагов являются крайне нежелательными по целому ряду причин, к числу которых в первую очередь следует отнести:

а) расчленение территории города, осложняющее его планировочное решение;

б) осложнение в связях между районами, с центром города и притягивающими центрами (культурными, спортивными и др.);

в) наличие в селитебной территории города неудобных и исключаемых из использования территорий, что не может не отражаться на экономике проектирования, строительства и эксплуатации города;

г) необходимость сооружения мостов и других сооружений в связи с переходом оврагов,

д) возможное разрушение зданий, сооружений, дорог и подземных коммуникаций города при росте оврагов и приближения их к этим сооружениям;

е) осушение территории, прилегающей к оврага вызывающее понижение влажности почвы (обсыхание), что плохо отражается на росте зеленых насаждений, а иногда и на устойчивости зданий и сооружений (изменение условий естественного основания);

ж) засорение русел рек и долин выносами грунта из оврагов.

При проектировании городов, в процессе решения вопросов планировки и застройки условия существования и использования оврагов изучаются в вариантах:

а) выделения территорий с оврагами, неудобных для застройки или иного использования вследствие крайне неблагоприятных условий, и исключаемых из общей площади города с сохранением оврагов в их естественном состоянии;

б) признания оврагов непригодными для градостроительных целей и исключения территории с оврагами из общей площади города с обязательным проведением мероприятий по инженерной подготовке, исключающих возможность роста и развития оврагов, опасных для зданий и сооружений, располагаемых вблизи этих оврагов;

в) установления возможности использования оврагов в градостроительных целях с обязательным выполнением специальных мероприятий по инженерной подготовке территорий с оврагами, в частности полной засыпки;

г) установления возможности использования оврагов в градостроительных целях без специальных мероприятий, с проведением обычных мер по благоустройству территорий.

Общие задачи инженерной подготовки территорий с оврагами включают:

а) предотвращение оврагообразования на территории города, а также на его резервных землях;

б) ликвидацию оврагов, наиболее опасных для зданий и сооружений города или затрудняющих осуществление планировочных решений;

в) борьбу с растущими оврагами, имеющую целью сохранение существующего положения (формы и размеры, стабильность склонов и т. д.);

г) инженерную подготовку территории оврагов к использованию их в градостроительных целях.

Характер и объем мероприятий определяются в зависимости от расположения оврагов на территории города. В сложившейся и застроенной части города мероприятия носят характер капитальных работ по ликвидации оврагов или при возможности и целесообразности градостроительного использования их обеспечения стабильности, т. е. приостановления роста оврагов, и мероприятий по инженерной подготовке и благоустройству таких территорий.

На вновь осваиваемых территориях мероприятия такого характера устанавливаются при планировочном решении городской территории, т. е. в генплане города. В зависимости от назначения и использования территорий с оврагами решаются вопросы их инженерной подготовки.

При развитой сети оврагов целесообразно составление специальной карты города с показанием всех оврагов и характеристикой каждого из них. На той же карте могут быть указаны мероприятия по инженерной подготовке и градостроительное использование каждого оврага.

Вопрос о рациональном использовании таких территорий решают на стадии разработки генерального плана города. Возможны варианты освоения овражных территорий для парков, зеленых зон, спортивных площадок, гаражей, водоемов и прокладки транспортных и подземных коммуникаций, размещения складских, а в некоторых случаях и гражданских зданий. Целесообразность вариантов градостроительного использования территории увязывают с размерами оврагов, классификация которых по этому признаку предусматривает разделение на мелкие, средние и крупные (табл. 18).

Таблица 18

В верховьях неглубоких оврагов можно устраивать подземные гаражи и автостоянки. При крутизне откосов оврага до 20 % целесообразно размещать служебные помещения на предварительно спланированных террасах откоса.

В более глубоких средних и устьевых участках оврага с пологими склонами наиболее удобно создавать парки и сады.

Традиционным приемом использования оврагов, расположенных в городской черте, является прокладка транспортных магистралей по дну оврага, а в некоторых случаях устройство вводов железнодорожных линий с развязками и пересечениями в разных уровнях. Это создает наилучшие условия для увеличения скоростей сообщения автомобильного транспорта, безопасного его движения, а также снижает уровень шума на прилегающей территории. В г. Нижний Новгород, например, по дну глубокого оврага, находящегося в центре города, проложена городская магистраль, которая связывает верхнюю и нижнюю части города.

По дну оврагов удобно прокладывать инженерные коммуникации, однако глубокие овраги для этой цели использовать не рекомендуется, поскольку при большой разности отметок прилегающей территории и дна оврага усложняются условия присоединения разводящей сети к магистральным коллекторам.

Состав мероприятий и конструкций используемых сооружений при инженерной подготовке территорий зависят не только от функционального использования территории, но и от того, где находится овраг; в городской черте или пригородной зоне. Меры защиты осуществляют как на прилегающей территории, так и в самом овраге.

Мероприятия на прилегающей территории позволяют устранить или уменьшить влияние основного фактора, вызывающего развитие оврага путем организации поверхностного стока и каптажа грунтовых вод.

В пределах оврага стабилизируют склоны и дно, подготавливая его к градостроительному использованию. Состав и особенности таких работ зависят от развития процесса оврагообразования, глубины, ширины и крутизны склонов оврага на верховом, среднем и устьевом участках.

Для оврагов, расположенных в черте города, в первую очередь организовывают поверхностный сток на прилегающей территории, предусматривая исключение сброса дождевых вод в овраг за счет обгонных водоотводящих систем, а при необходимости проектируют и дренажные устройства. Одновременно планируют склоны оврага, делая их более пологими, сопровождая вертикальную планировку защитой склонов от водной и ветровой эрозии.

При высоте откосов более 5-6 м по соображениям обеспечения устойчивости устраивают бермы ширину которых принимают не менее 2 м. Нередко бермы используют в качестве пешеходных дорожек, тогда их ширину назначают в соответствии с требованиями горизонтальной планировки. Поперечный уклон берм проектируют в сторону водоотводного лотка, а его размещают у основания вышележащего склона.

К террасированию склонов прибегают в тех случаях, когда на склонах оврага размещают здания (схема в). Уполаживание и террасирование склонов обычно сочетается с креплением их поверхности. Для этого на склонах сеют травы, укладывают дерн, сажают деревья, а на некоторых участках применяют каменные материалы.

Поперечное сечение оврага засыпают частично, когда по его дну проектируют дороги или другие инженерные сооружения (рис. 51, а, б).

Рис. 51. Варианты инженерной подготовки оврагов:

Page 21

При такой частичной ликвидации оврага глубину засыпки назначают с учетом нормативных продольных уклонов дорог, пешеходных дорожек и нормальных условий размещения и эксплуатации подземных коммуникаций.

Поперечное сечение оврага засыпают полностью, как правило, лишь в верховой части, где склоны круты, а ширина поверху незначительна (рис. 34, г).

При необходимости засыпают и боковые ответвления — отвершки. Ликвидация оврага должна быть обоснована технико-экономическими расчетами на основе анализа различных вариантов планировочного решения и соответствующего этим вариантам метода инженерного освоения овражных территорий.

Обычно полная ликвидация оврага вызвана строительством в непосредственной близости от бровки оврага капитальной застройки, так как для размещения зданий засыпанные овраги используют редко. Это объясняется рядом причин. Во-первых, даже при наличии оптимального гранулометрического состава засыпки и использования метода регулирования здания приходится возводить на свайных фундаментах. Во-вторых, стабилизация насыпного грунта требует времени, а при сухой укладке — еще и предварительного уплотнения. В-третьих, при замыве оврага нельзя полностью исключить возможность обрушения склонов, особенно сложенных глинистыми грунтами.

Приближение зданий к бровке уположенного откоса или засыпанного оврага ограничивают безопасным расстоянием. Это расстояние назначают не менее 20 м от бровки уположенного до устойчивого состояния откоса. На засыпных — определяют аналогично, т. е. расстояние исчисляют от вероятной линии уположенного откоса, положение которой легко установить, зная требуемый угол а.

Когда овраг находится на резервной территории города и ее освоение намечают на далекую перспективу, практикуют частичную или полную засыпку строительным, а иногда и бытовым мусором. Размещение таких свалок возможно, если обеспечен санитарно-защитный разрыв от застройки не менее 500 м, а засыпка мусором допустима после согласования с органами санитарного надзора. Использование для градостроительных нужд оврагов, засыпанных мусором, возможно после полного его обезвреживания, по прошествии 10-20 лет, поэтому такой метод ликвидации оврагов нельзя считать перспективным.

Поверхностный сток в овраге организовывают, собирая ливневые воды системой лотков, расположенных на бермах или по дну, и отводя их в места сброса. На засыпанных участках оврага предварительно укладывают дождевой, а при необходимости и дренажный коллектор.

Для защиты от размыва лотки открытой системы укрепляют, а их поперечное сечение определяют с учетом пропуска расчетных расходов и создания неразмывающих скоростей.

В отдельных случаях по планировочным или техническим соображениям приходится сбрасывать в овраг поверхностные воды с прилегающей территории. Тогда по дну оврага проектируют комплекс специальных водопропускных устройств (рис. 52). В вершине оврага предусматривают быстротоки или ступенчатые перепады с водобойными колодцами. На этом участке защиту дна от размыва можно устраивать с помощью мощения камнем или облицовкой плитами по предварительно спланированной поверхности. Такое решение приемлемо на ранних стадиях развития оврага, когда «врезание» его дна в толщу грунтов только начинается.

Рис. 52. Устройства, предотвращающие овражную эрозию:

а, б, в — верхняя, средняя и устьевая часть оврага; 1 — застройка; 2 — водосточный коллектор; 3 — многоступенчатый перепад; 4 — бетонное крепление склона; 5 — запруда; 6 — водоотбойное мощение; 7 — травяной покров и кустарники у подошвы склона

На более пологих участках в средней части дна оврага проектируют запруды и водобойное крепление. Эти устройства являются малыми гидротехническими сооружениями, выполняющими противоэрозионную роль. Их параметры определяются соответствующими расчетами. Водосливные запруды, расположенные поперек потока, позволяют уменьшить скорость воды и уполаживают дно за счет аккумуляции наносов между искусственно созданными преградами.

Запруды представляют собой сооружения высотой 0,5-1,5 м. Это одно- и двухрядные фашинные или каменные стенки. Промежутки между ними заполняют мятой глиной, камнем или фашинами. В ответственных случаях используют и стены из шпунтового ряда свай.

Наиболее капитальные — бетонные и железобетонные запруды. Их делают монолитными или собирают из сборных деталей — железобетонных плит. Участки между запрудами заполняют утрамбованной глиной, камнем или фашинами.

Для защиты дна от размыва на участке за запрудами создают водобойные крепления, которые устраивают длиной не менее 2,5 м. Их выполняют из каменной наброски или бетонных плит. Если высота запруд невелика, то водобойные крепления могут быть облегченными, так как размывающая сила потока не столь велика, как при высоких запрудах. Здесь достаточно устроить хворостяную выстилку по слою утрамбованной глины, обжимаемой ивовыми кольями. Подошвы откосов также закрепляют; укладывают плиты или сажают кустарник.

В устьевой части дна оврага, там, где продольные уклоны по дну незначительны, для закрепления достаточно использовать посадку кустарников у подошвы склона и посев трав в зоне движения потока.

В пригородах на прилегающей к оврагу водосборной площади проводят лесомелиоративные работы в сочетании с устройством простейших гидротехнических сооружений. Все это включает посадку защитных лесополос и создание системы нагорных перехватывающих и водоотводящих канав. На обрабатываемых сельскохозяйственных землях в первую очередь проводят агротехнические и лесомелиоративные мероприятия. Если же они неэффективны, то дополнительно проектируют земляные гидротехнические сооружения.

К ним относят горизонтальные и наклонные валы-террасы, водозадерживающие и водоотводящие валы-канавы, распылители стока. Валы-террасы создают для сокращения скорости cтокa поверхностных вод и одновременного уменьшения уклонов на склонах. Террасы размещают поперёк движения воды вдоль горизонталей рельефа, обычно на обрабатываемых сельскохозяйственных угодьях с уклонами поверхности 3-80. Вдоль вала-террасы проектируют залуженный водосброс для излишней воды.

Рис. 53. Противоэрозионные гидротехнические сооружения:

1— водозадерживающий или водоотводящий вал; 2 — граница уполаживания склона; 3 — донный водовыпуск; 4 — водоотводящий вал; 5 — водосбросное сооружение; 6 — распылитель (земляной вал); 7 — лоток (выемка)

Для отвода дождевых вод проектируют водозадерживающие валы, которые располагают у вершины оврага (рис. 53, а) или несколько ниже. Многорядная система валов, размещенных выше вершины оврага, связана с потерей больших площадей. Очевидные преимущества с этой точки зрения имеет устройство одного вала по схеме б, задерживающего большие объемы стока.

Водозадерживающие валы особенно эффективны, когда имеются глубокие, сильно разветвленные овраги с крутыми откосами, а склоны водосборной площади равномерно, амфитеатром спускаются к оврагу. Тогда размещают дугообразные в плане валы, охватывающие вершину оврага. Такие валы трассируют по горизонталям, обеспечивая задержание всего стока, направляющегося к вершине, и исключая, таким образом, необходимость устройства дорогостоящих креплений вершины.

Следует иметь в виду, что водозадерживающие валы играют вспомогательную роль в регулировании стока на прилегающей территории, поэтому их проектируют в сочетании с противоэрозионными мероприятиями на откосах оврага.

Водоотводящие валы-канавы применяют для перехвата и отвода поверхностных вод от оврагов с большим числом ответвлений.

Рис. 54. Поперечные профили водозадерживающих и водоотводящих валов-канав: а — треугольный; б — трапециевидный;

1 — земляной вал; 2 — прудок-канава; 3 — расчетный уровень воды в прудке; 4 — уровень поверхности территории

Размещение их в плане определяется топографическими особенностями территории (рис. 36). Поперечное сечение водозадерживающих и водоотводящих валов-канав может быть двух вариантов (рис. 54). Параметры сечения определяют специальным расчетом для ливневого стока 10 %-ной обеспеченности. При этом отметку гребня проектируют обычно не менее, чем на 0,2 м выше расчетного уровня воды при расходах до 1 м3/с, если расходы стока находятся в пределах 1-10 м3, превышение делают не менее 0,4-0,5 м.

Опыт строительства и эксплуатации валов показал, что наиболее целесообразны широкие валы-ложбины с пологими откосами имеющие глубину Нп 0,5-0,6 м и ширину по дну 1,0-1,5 м. Такие земляные сооружения, расположенные обычно на сельскохозяйственных землях, не создают трудностей для прохождения механизмов и хорошо сохраняются при обработке полей.

Продольный уклон канав назначают по тем же принципам, что и открытой дождевой сети: скорость стекания воды вдоль вала должна быть менее критической размываемой и исключать заиление. Если канавы имеют большую протяженность, то их поперечное сечение, определяемое расчетом, делают переменным по длине. По мере увеличения водосборной площади поперечное сечение канавы увеличивают, и лишь при небольших расходах (до 1 м3/с) канавы могут иметь постоянные размеры поперечного сечения.

При пересечении канавами глубоких ложбин необходимо обеспечить безопасный сброс воды из образующихся в ложбине прудков, поэтому в таких случаях проектируют заужение дна канав, а в тело земляного вала закладывают дренажную призму.

Распылители стока представляют собой простейшее земляное сооружение (валик) с параллельно расположенным лотком, перегораживающее ложбину под углом 45° (рис. 54, г). Такие сооружения позволяют рассредоточить водный поток и ослабить его разрушительную (размывающую) силу.

При проектировании распылителей определяют длину валиков и выемок, их размещение на местности и конструктивные элементы. Специальных расчетов при этом не требуется, так как параметры зависят от ширины и глубины естественной ложбины или других препятствий, вызывающих концентрирование стока.

Рассмотренные выше водоотводящие сооружения проектируют комплексно. Они в сочетании с другими мероприятиями составляют общую систему регулирования поверхностного стока на прилегающей территории.

Рис. 55. Размещение лесопосадок в сочетании с водоотводящими валами-канавами

Так, защитные лесопосадки, размещенные поперек стока, способны повлиять на его регулирование и задержать эрозионные процессы. Правда, как единственное противоэрозионное мероприятие, они чаще всего неэффективны, но в сочетании с валами-канавами и другими водоотводящими сооружениями дают соответствующий эффект (рис. 55). Ширину приовражных лесополос определяют, учитывая противоэрозионный эффект леса и условия рационального использования приовражной территории.

В состав элементов водоотводящих систем входят устраиваемые в оврагах головные, донные и русловые противоэрозионные сооружения, аналогичные применяемым в городе. Однако их конструкции выполняют из менее дорогостоящих материалов. Например, быстротоки устраивают из хвороста или фашин, реже — камня, а запруды делают из простейших конструкций.

К закреплению склонов оврага на пригодных территориях прибегают в тех случаях, когда необходимо в короткий срок предотвратить его разрушение. Тогда предварительно путем срезки верхней части и перемещением грунта в нижнюю планируют устойчивый откос. Для закрепления склонов используют многолетние травы, дерн, плетни и камень, в некоторых случаях даже хворост.

Террасирование склонов оврага на природных территориях экономически целесообразно в случае использования террас под лесные и плодовые насаждения, что высвобождает площади равнинных земель под посев других сельскохозяйственных культур.

Page 22

Для инженерной защиты зданий и сооружений от карста применяют следующие противокарстовые мероприятия или их сочетания:

- планировочные;

- водозащитные и противофильтрационные;

- геотехнические (укрепление оснований);

- конструктивные;

- технологические;

- эксплуатационные.

Противокарстовые мероприятия должны:

- предотвращать активизацию, а при необходимости и снижать активность карстовых и карстово-суффозионных процессов;

- исключать или уменьшать в необходимой степени карстовые и карстово-суффозионные деформации грунтовых толщ;

- предотвращать повышенную фильтрацию и прорывы воды из карстовых полостей в подземные помещения и горные выработки;

- обеспечивать возможность нормальной эксплуатации территорий, зданий, сооружений, подземных помещений и горных выработок при допущенных карстовых проявлениях.

Планировочные противокарстовые мероприятия должны обеспечивать рациональное использование закарстованных территорий.

В состав планировочных противокарстовых мероприятий входят:

- Специальная компоновка функциональных зон, трассировка магистральных улиц и сетей при разработке планировочной структуры с максимально возможным обходом карстоопасных участков и размещением на них зеленых насаждений;

- Разработка инженерной защиты территорий от техногенного влияния строительства на развитие карста;

- Расположение зданий и сооружений на менее опасных участках, как правило, за пределами участков I-II категорий устойчивости относительно интенсивности карстовых провалов , а также за пределами участков с меньшей интенсивностью (частотой) образования провалов, но со средними их диаметрами больше 20 м .

Водозащитные и противофильтрационные противокарстовые мероприятия обеспечивают предотвращение опасной активизации карста и провальных явлений под влиянием техногенных изменений гидрогеологических условий в период строительства и эксплуатации зданий и сооружений.

Основным принципом проектирования водозащитных мероприятий на закарстованных территориях является максимальное сокращение инфильтрации поверхностных, промышленных и хозяйственно-бытовых вод в грунт.

К водозащитным мероприятиям относятся:

- тщательная вертикальная планировка земной поверхности и устройство надежной ливневой канализации с отводом вод за пределы застраиваемых участков;

- мероприятия по борьбе с утечками промышленных и хозяйственно-бытовых вод, в особенности агрессивных;

- недопущение скопления поверхностных вод в котлованах и на площадках в период строительства, строгий контроль за качеством работ по гидроизоляции, укладке водонесущих коммуникаций и продуктопроводов, засыпке пазух котлованов.

При проектировании водохранилищ, водоемов, каналов, шламохранилищ, систем водоснабжения и канализации, дренажей, водоотлива из котлованов, горных выработок и др. должны учитываться гидрологические и гидрогеологические особенности карста. При необходимости применяют противофильтрационные завесы и экраны, регулирование режима работы гидротехнических сооружений и установок и т.д.

К геотехническим мероприятиям относятся:

- тампонирование карстовых полостей и трещин, обнаруженных на земной поверхности, в котлованах и горных выработках (шурфах, штольнях и т.д.);

- закрепление закарстованных пород и (или) вышезалегающих грунтов инъекцией цементационных растворов или другими способами;

- опирание фундаментов на надежные незакарстованные или закрепленные грунты.

С целью опирания на надежные грунты применяют:увеличение глубины заложения фундаментов, забивные, бурозабивные или буронабивные сваи, другие фундаменты глубокого заложения, замену ненадежных грунтов и другие мероприятия.

Технологические противокарстовые мероприятия включают: повышение надежности технологического оборудования и коммуникаций, их дублирование, контроль за давлением в коммуникациях и утечками из них, обеспечение возможности своевременного отключения аварийных участков и т.д.

В состав эксплуатационных противокарстовых мероприятий (мониторинга) входят:

- постоянный геодезический контроль за оседанием земной поверхности и деформации зданий и сооружений;

- наблюдения за проявлениями карста, состоянием грунтов, уровнем и химическим составом подземных вод;

- переодическое строительное обследование состояния зданий, сооружений и их конструктивных элементов;

- система автоматической сигнализации на случай появления недопустимых карстовых деформацией;

Page 23

Инженерная защита от морозного (криогенного) пучения грунтов необходима для легких малоэтажных зданий и других сооружений для различных линейных сооружений и коммуникаций (трубопроводов, ЛЭП, дорог, аэродромов, линий связи).

Противопучинные мероприятия применяют в случае, если устойчивость сооружения, рассчитываемая на действие сил пучения, не компенсируется нагрузкой от сооружения, а также при необходимости уменьшения пучения или полном его устранении.

При промерзании грунта пучение частично компенсируется усадкой грунта немерзлой зоны, а при оттаивании грунта происходит опускание поверхности за счет осадки грунта.

Морозное пучение грунтов проявляется в следующих случаях:

- сезонное и многолетнее пучение грунтов основания на контакте с инженерными сооружениями, обычно с их фундаментами, приводящие к возникновению нормальных и касательных сил пучения, определяющих деформации сооружений;

- пучины на дорогах, естественных грунтов оснований и искусственных грунтов дорожного полотна, проявляющиеся в виде сезонных бугров различной формы и размеров.

Требования к мероприятиям для защиты от морозного пучения грунтов.Данные мероприятия подразделяют на следующие виды:

- инженерно-мелиоративные (тепломелиорация и гидромелиорация);

- конструктивные;

- физико-химические (засоление, гидрофобизация грунтов и др.);

- комбинированные.

Тепломелиоративные мероприятия заключаются в теплоизоляции фундамента; прокладка вблизи фундамента по наружному периметру подземных коммуникаций, выделяющих в грунт тепло.

Гидромелиоративные мероприятия сводятся к понижению уровня грунтовых вод, осушению грунтов в пределах сезонно-мерзлого слоя и предохранению грунтов от насыщения поверхности атмосферными и производственными водами. Применяют открытые и закрытые дренажные системы (лотки, канавы, трубы).

Конструктивные противопучинные мероприятия предусматривают:

- для снижения усилий, выпучивающих фундамент;

- для заанкерирования фундаментов в талых и мерзлых грунтах, залегающих глубже сезонно-промерзающего слоя;

- для приспособления фундаментов и наземной части сооружения к неравномерным деформациям пучинистых грунтов.

Для снижения касательных сил пучения следует:

- проектировать сооружения на столбчатых и свайных фундаментах;

- уменьшать число отдельно стоящих опор фундаментов с целью увеличения нагрузки на каждую опору;

- уменьшать сечение столбчатых фундаментов и свай в пределах промерзающего слоя;

- устраивать у железобетонных фундаментов наклонные боковые грани (10 – 20), обеспечивающие увеличение сопротивления фундамента действию касательных сил пучения.

Для приспособления конструкций фундаментов и наземной части зданий к неравномерным деформациям пучинистых грунтов следует применять:

- устройство в каменных стенах и фундаментах железобетонных поясов;

- устройство осадочных швов в сооружениях;

- устройство под зданием (сооружением) сплошных подсыпок из непучинистых грунтов (песок, гравий, щебень).

Физико-химические противопучинные мероприятия сводятся к специальной обработке грунта вяжущими и стабилизирующими веществами.

При необходимости в проекте следует предусматривать проведение наблюдений (мониторинга) для обеспечения надежности и эффективности применяемых противопучинных мероприятий. Наблюдения должны проводиться за влажностью грунта, режимом промерзания грунта, пучением и деформацией сооружений в предзимний и в конце зимнего периода.

Контрольные вопросы по 3-му разделу

1. Мероприятия по защите территории от подтопления.

2. Мероприятия по защите территории от затопления.

3. Противооползневые и противообвальные мероприятия по защите территории

4. Инженерные мероприятия по борьбе с оврагами

5. Противокарстовые мероприятия

Рекомендации по устройству инженерных сооружений

Подпорные стены

В условиях строительства гражданских зданий подпорные стены назначаются для ограждения террас, уступов планировки и ограждения котлованов на время производства работ.

Подпорные стены, в том числе служащие ограждениями котлованов, в зависимости от их конструкции классифицируют на:

- гравитационные, устойчивость которых обеспечивается собственным весом конструкций и грунта засыпки. К гравитационным относятся массивные, уголковые и ячеистые подпорные стены;

-гибкие, устойчивость которых обеспечивается заделкой в грунтовом массиве, анкерными и распорными конструкциями. К гибким относятся «стены в грунте», шпунтовые ограждения котлованов и ограждения из свай и профильных прокатных элементов;

- комбинированные, представляющие собой сочетание первого и второго вида.

Конструктивные схемы подпорных стен должны обеспечивать необходимую прочность, устойчивость и пространственную неизменяемость в целом, а также отдельных его элементов на всех стадиях возведения и эксплуатации.

При проектировании подпорных стен следует учитывать:

- технологические особенности возведения и последовательность строительных операций;

- возможность использования анкерных или распорных конструкций;

- изменения физико-механических характеристик грунтов, связанные с процессами бурения, забивки и другими технологическими воздействиями;

- необходимость обеспечения требуемой водонепроницаемости конструкций;

- необходимость передачи на конструкцию вертикальных нагрузок;

- возможность применения конструктивных решений и мероприятий по снижению давлений на подпорные стены (разгружающих элементов, геотекстиля, армогрунта и пр.).

Рис. 56. Подпорная стенка со слезником:

1 - песчаная засыпка; 2 - глинистый грунт

Рис. 57. Схемы устройства подпорных стен:

а – из монолитного железобетона; б - из сборных (бетонных) блоков; 1 - песчаная или щебеночная подушка; 2 - подпорная стена; 3 - строительный наклон; 4 - засыпка песком; 5 - гидроизоляция;

6 - дренаж; 7 - дренажные отверстия; 8 - естественный грунт

Подпорные стены проектируются массивные, тонкие и заделанные в основание или уголковые (рис 56, 57). С целью лучшего использования материала сечения массивных и уголковых стен следует назначать сужающимися кверху или уступчатыми.

Подпорные стены ограждения котлованов на время производства работы рекомендуется делать, как правило, из металлического шпунта с последующим извлечением. Ограждение котлованов, оставляемое в грунте, можно делать их железобетонных шпунтовых свай (шпунта) или выполнять способом «стена в грунте».

При небольшой глубине котлованов ограждение может быть назначено из деревянного шпунта.

Подпорные стены, ограждающие подвалы зданий, являющиеся часть фундаментов, рекомендуется делать из сборных бетонных блоков или панелей с облицовкой в пределах цоколя.

Подпорные стены, ограждающие стилобаты, террасы и уступы планировки, целесообразно предусматривать из монолитного бетона или железобетона или сборными из бетонных стеновых блоков (фундаментных). Сборные стены из бетонных блоков могут иметь армирование в швах, в зависимости от расчетной схемы.

Подпорные стены, имеющие архитектурное оформление в виде облицовки естественными или искусственными плитами, рекомендуется делать из монолитного железобетона.

Расчет подпорных стен производится по первой и второй группам предельных состояний.

Расчеты подпорных стен и их оснований по первой группе предельных состояний должны включать проверку:

- устойчивости положения стены против сдвига, опрокидывания и поворота;

- устойчивости, несущей способности и прочности основания;

- прочности элементов конструкций и узлов соединения;

- несущей способности анкерных элементов по материалу и грунту;

- прочности и устойчивости распорных элементов;

- фильтрационной устойчивости основания.

В проекте следует назначать строительный наклон стены обычно в сторону засыпки, который по верху стены должен быть не менее 20 мм.

Конструкция подпорных стен.Температурные швы в подпорных стенах назначаются в зависимости от конфигурации в плане, но не реже, чем через 40 м.

Все вертикальные швы кладки подпорных стен из бетонных блоков должны быть тщательно заполнены раствором. Со стороны гидроизоляции швы необходимо затирать цементным раствором, углы уступов и в поворотах стены закруглять; при оклеечной изоляции радиус закругления должен быть не менее 100 мм, при обмазочной – 50 мм.

Облицовка поверхностей плитами из естественного камня или керамики по фасаду должна иметь горизонтальные и вертикальные швы толщиной не более 10 мм с полным заполнением раствором швов и пространства между плитами и конструкцией стены, которое должно быть более 10 мм.

Для подземных сооружений, возводимых способом «стена в грунте», инженерно-геологическое строение и гидрогеологические условия площадки должны быть изучены на глубину не менее чем на 10 м ниже подошвы стены.

Проектом должны быть предусмотрены работы по очистке дна траншей от шлама разрабатываемого грунта и раствора глины, а также возможных вывалов грунта. В случае необходимости (траншейные фундаменты и др.) проектом должно быть предусмотрено уплотнение грунта основания втрамбовыванием щебня или бетонной смеси класса В10.

При расчете стен подземных помещений и фундаментов, устраиваемых способом «стена в грунте», учитываются нагрузки и воздействия, возникающие в условиях строительства и эксплуатации возводимых сооружений, а также от сооружений, расположенных вблизи от них.

В процессе проектирования «стен в грунте», кроме расчета по несущей способности и деформациям, должны производиться: подбор состава глинистого раствора в соответствии с требованиями «Руководства по расчету «стен в грунте», определение допустимой длины одновременно отрываемого участка (захватки) траншей и устойчивости ее стен.

Длина захватки траншей назначается из условий устойчивости массива грунта, прилегающего к траншее, от нагрузок, расположенных на поверхности грунта, и фундаментов соседних сооружений расположенных в пределах призмы обрушения.

Устойчивость стен траншей в случае необходимости может быть обеспечена за счет повышения плотности глинистого раствора, разница уровней раствора и подземных вод, а также за счет уменьшения длины захватки.

4.2. Конструкция «стен в грунте».«Стены в грунте» могут проектироваться различного очертания в плане из монолитного или сборного железобетона, а также сборно-монолитные. Выбор типа производится на основании технико-экономического сопостовления вариантов.

Траншею при устройстве «стен в грунте» необходимо разбивать на отдельные захватки, отрываемые и бетонируемые с разрывами через одну. Рекомендуется назначать длину захватки 3-6 м.

Если грунт не меняет свои свойства при динамике, при устройстве «стены в грунте» вблизи существующих зданий или сооружений ее следует делать в виде секущихся свай. Разбуренные под глинистым раствором скважины должны немедленно заполняться бетонной смесью.

В качестве ограничителей захваток, в зависимости от конструкций стыка, рекомендуется принимать инвентарные стальные трубы, опускаемые в траншею на границе захватки и извлекаемые после укладки бетона или разграничительные железобетонные элементы, входящие впоследствии в состав стены.

Арматурный каркас должен иметь размеры: длину на 20-30 см меньше глубины траншей, толщину на 10-15 см меньше ширины траншей и ширину на 10 см меньше длины захватки между ограничителями. В каркасе должны быть предусмотрены проемы для установки бетонолитной трубы.

На чертежах конструкций, выполняемых способом «стена в грунте», кроме общих примечаний и указаний, должны быть приведены размеры захваток, плотность глинистого раствора, сроки заполнения захваток бетоном и другие требования, обеспечивающие прочность и жесткость сооружения.

Приемка готовых подземных частей сооружений и фундаментов, выполненных способом «стена в грунте», должны производиться с проверкой соответствия их показателей по прочности, устойчивости, сплошности и водонепроницаемости, предусмотренных в проекте.

Работы по устройству «стен в грунте» производятся с соблюдением на различных этапах строительства следующих требований:

- при устройстве форшахты расстояние между внутренними ее гранями должно быть больше ширины рабочего органа траншеекопателя на 100 мм;

- глубина траншеи проверяется по всей длине захватки и должна разрабатываться глубже проектной отметки на 200-250 мм;

- текущий контроль качества глинистого раствора производится не реже одного раза в смену с отбором проб раствора из траншеи;

- перед монтажом сборные железобетонные панели должны тщательно осматриваться и проверяться на их соответствие проекту.

Результаты каждой операции по контролю качества должны отражаться в соответствующих документах.

Грунтовые анкеры

Грунтовые анкеры – устройства для передачи растягивающих усилий на глубокие слои грунта. Анкеры применяются для закрепления: подпорных стен, шпунтовых ограждений и других целей.

Заделку анкеров не допускается осуществлять в торфах, илах, текучих и текучепластичных пылевато-глинистых грунтах.

Анкер состоит из заделки (корня), передающей усилие от закрепляемой конструкции на грунт, тяги – соединяющей закрепляемую конструкцию с заделкой и стопорного устройства (оголовка), закрепляющего анкер на конструкции (рис. 58).

Рис. 58. Схемы анкеров:

а – с разбуренным уширением; б - с инъекционным уширением

Анкеры подразделяются: по направлению тяги – наклонные и вертикальные; по способу образования скважин – буровые с проходкой скважин с обсадными трубами, под глинистым раствором, шнеком и с погружением обсадной трубы забивкой или вдавливанием; по способу устройства – инъекционные (скважина в зоне заделки заполняется цементным раствором под давлением), с разбуренным уширением и цилиндрические (скважина заполняется цементным раствором без избыточного давления); по материалу анкерных тяг – из стержневой и тросовой арматуры; по сроку службы – временные (до 2 лет) и постоянные.

Подпорные стены и ограждения котлованов могут быть закреплены одним или несколькими ярусами анкеров. Число ярусов, шаг, угол наклона, конструкция и размеры анкеров должны определяться расчетом в зависимости от высоты и конструкции закрепляемой стенки, грунтовых условий и несущей способности анкеров.

Тип анкера должен назначаться исходя из расчетной выдергивающей нагрузки, вида грунтов, условий производства работ, обеспеченности строительной организации необходимыми материалами и оборудованием, на основании технико-экономического сравнения различных вариантов.

Наклон анкеров назначается в зависимости от залегания слоя грунта, пригодного для размещения заделки анкера.

Расчет анкеров выполняется по первому предельному состоянию, исходя из заданной величины расчетной выдергивающей нагрузки, определяемой расчетом конструкции, удерживаемой от смещения анкерами.

Производится проверка несущей способности анкера по грунту, по прочности его узлов и стопорного устройства, закрепляющего тягу на конструкции. Установление несущей способности анкеров для стадии рабочей документации должно производиться по результатам испытаний их статистической нагрузкой.

Грунтовые анкеры, используемые для крепления подпорных стен и ограждений котлованов, подразделяют на временные (со сроком работы до двух лет) и постоянные.

Проектирование анкеров должно основываться на результатах статических расчетов системы «стена – грунтовый массив», в которых должна быть определена осевая нагрузка на анкеры с учетом требуемого числа ярусов анкеров, их расположения, углов наклона анкеров к горизонту и углов отклонения анкеров от нормали к стене.

При проектировании анкеров определяют: число анкеров в ярусе и их шаг; свободную длину анкерных тяг, обеспечивающую размещение заделки анкеров за пределами границы призмы обрушения; предварительную длину заделки анкеров, требуемую для восприятия проектных усилий; места для устройства опытных анкеров; число контрольных испытаний анкеров и порядок их выполнения. Уточняют усилия, на которые должны быть напряжены анкеры, после проведения контрольных и приемочных испытаний.

Контрольные вопросы по 4-му разделу

1. Назовите основные рекомендации по устройству подпорных стен.

2. Назовите основные рекомендации по устройству «стены в грунте».

3. Назовите основные рекомендации по устройству грунтовых анкеров. Заключение

При осуществлении инженерной защиты необходимо руководствоваться соответствующими законодательными и нормативными актами Российской Федерации и субъектов Российской Федерации.

Необходимость инженерной защиты определяется в соответствии с положениями Градостроительного кодекса Российской Федерации в части градостроительного планирования развития территории субъектов Российской Федерации, городов и сельских поселений:

- для вновь застраиваемых и реконструируемых территорий – в проекте генерального плана с учетом вариантности планировочных и технических решений;

- для застроенных территорий в проектах строительства, реконструкции и капитального ремонта зданий и сооружений с учетом существующих планировочных решений и требований заказчика.

Проектирование инженерной защиты следует выполнять на основе:

- результатов инженерно-геодезических, инженерно-геологических, инженерно-гидрологических, инженерно-гидрометеорологических и инженерно-экологических изысканий для строительства;

- планировочных решений и вариантной проработки решений, принятых в схемах (проекта) инженерной защиты;

- данных, характеризующих особенности использования территорий, зданий и сооружений как существующих.

При проектировании инженерной защиты следует обеспечивать (предусматривать):

- предотвращение, устранение или снижение до допустимого уровня отрицательного воздействия на защищаемые территории, здания и сооружения действующих и связанных с ними возможных опасных процессов;

- наиболее полное использование местных строительных материалов и природных ресурсов;

- производство работ способами, не приводящими к появлению новых и (или) интенсификации действующих геологических процессов;

- сохранение заповедных зон, ландшафтов, исторических объектов и памятников и т.д.;

- надлежащее архитектурное оформление сооружений инженерной защиты;

- сочетание с мероприятиями по охране окружающей среды;

Мероприятия по инженерной защите и охране окружающей среды следует проектировать комплексно, с учетом прогноза ее изменения в связи с постройкой сооружений инженерной защиты и освоения территории. При этом мероприятия инженерной защиты от разных видов опасных процессов должны быть увязаны между собой.

Инженерную защиту застроенных или застраиваемых территорий от одного или нескольких опасных геологических процессов следует осуществлять независимо от формы собственности и принадлежности защищаемых территорий и объектов, при необходимости предусматривать образование единой территориальной системы (комплекса) мероприятий и сооружений.

Выбор мероприятий и сооружений следует производить с учетом видов возможных деформаций и воздействий, уровня ответственности и стоимости защищаемых территорий, зданий и сооружений, их конструктивных и эксплуатационных особенностей.

В случае, когда сооружения и мероприятия инженерной защиты могут оказать отрицательное влияние на эти территории (заболачивание, разрушение берегов, образование и активизация оползней и др.), в проекте должны быть предусмотрены соответствующие компенсационно-восстановительные мероприятия.

В необходимых случаях в проекте следует предусматривать установку контрольно-измерительной аппаратуры и устройство наблюдательных скважин, постов, геодезических реперов, марок и т.д. для наблюдения в период строительства и эксплуатации за развитием опасных процессов и работой сооружений инженерной защиты.

Уровень ответственности (класс) сооружений инженерной защиты следует назначать в соответствии с уровнем ответственности или классом защищаемых объектов.

Экономический эффект варианта инженерной защиты определяют размером предотвращенного ущерба территории или сооружению от воздействия опасных процессов за вычетом затрат на осуществление защиты.

Все проекты инженерной защиты должны содержать оценку возможных последствий техногенных воздействий на окружающую природную среду, основывающуюся на прогнозах динамики природных процессов: геодинамических, гидрологических, гидрохимических, геотермических, биологических, возникающих в результате воздействия затопления и подтопления, а также прогнозов изменений паразитологической ситуации.

При устройстве защитных сооружений допускается применять в качестве строительных материалов грунты и отходы производства, не загрязняющие окружающую природную среду.

В проектах строительства объектов инженерной защиты необходимо предусматривать централизованное водоснабжение и канализацию защищаемых населенных пунктов с учетом существующих гигиенических требований.

Содержание

Введение ……………………………………………………….…………..…3

1. Особенности проектирования и реализации инженерной подготовки территорий ………………………………………………………..…………………4

1.1. Общие вопросы…………………………………………...………..…..4

1.2. Учет основных факторов, влияющих на проектирование и реализацию мероприятий по инженерной подготовке…………………...4

1.3. Особые условия инженерной подготовки территорий……….…....17

1.4. Решение вопросов инженерной подготовки территорий на разных стадиях градостроительного проектирования …………………………….......…26

Контрольные вопросы по 1-му разделу……………………………………40

2. Вертикальная планировка территорий и организация стока поверхностных вод…………………………………………………..……………..41

2.1. Вертикальная планировка территорий…………………….……….….41

2.2. Методы и стадии проектирования………………………..……..……. 47

2.3. Инженерные сети на улицах города ………….……………………….55

2.4. Организация стока поверхностных вод ……………………………….57

2.4.1. Открытая дождевая сеть………………………………………...……60

2.4.2. Закрытая дождевая сеть………………………………………………63

Контрольные вопросы по 2-му разделу…………………...……………. 78

3. Инженерная защита территорий………………………………..………78

3.1. Факторы подтопления… ……………………………………………..78

3.2.Защита территорий и зданий от подтопления …… ………………….80

3.2.1. Состав мероприятий по защите от подтопления……………………82

3.2.2. Назначение дренажей…………………………………………………84

3.2.3. Типы дренажей……………………………………………………..…87

3.3.Защита территорий от затопления …………………………….……..100

3.3.1. Методы защиты территорий от затопления…………………….…101

3.3.2. Обваловывание территорий…………………………………………102

3.3.3. Укрепление берегов………………………………………...……….110

3.3.4. Искусственное повышение поверхности территории……………..113

3.3.5. Выбор мероприятий по инженерной защите от затопления….….121

3.4.Инженерная защита территорий, зданий и сооружений от опасных геологических процессов………………………...................................................127

3.4.1. Характеристики процессов………………………………………….127

3.4.2. Инженерная подготовка оползневых территорий………… …….145

3.4.3. Противооползневые и противообвальные сооружения и мероприятия……………………………………………………………………….164

3.5. Инженерные мероприятия по борьбе с оврагами …………..………169

3.6. Противокарстовые мероприятия……………………………………...188

3.7. Мероприятия для зашиты от морозного пучения грунтов………....190

Контрольные вопросы по 3-му разделу……………………………...…...191

4. Рекомендации по устройству инженерных сооружений……………..192

4.1 Подпорные стены………………………………………………………192

4.2. Конструкция «стена в грунте»………………………………………..196

4.3. Грунтовые анкеры…………………………………………..…….…...197

Контрольные вопросы по 4-му разделу……………………………...…...198

Заключение ……………………….…………………………………..……199

Литература………………………………………………………...………. 204

Проверить страницы

Литература

Page 24

Первый тип — асеквентные, которые развиваются обычно в однородных связных грунтах и имеют криволинейную цилиндрическую поверхность скольжения, положение которой зависит от величины сил трения и сцепления. Классический оползень с правильной круглоцилиндрической поверхностью смещения сравнительно редок, поскольку естественные склоны, как правило, неоднородны, чаще всего они имеют сложное строение. Оползни описываемого типа характерны для искусственных склонов, например в дамбах или дорожных насыпях. Движение оползня может быть прогрессирующим, т. е. первоначально сдвиг может произойти не сразу по всей поверхности смещения, а развиваться постепенно, начиная с участка локального разрушения. Если поверхность смещения у нижней границы оползня наклонена в глубь массива, то смещение оползня может остановиться, так как момент сдвигающей силы во время движения уменьшается.

Второй тип — консеквентные оползни, для которых характерно смещение по поверхности напластования, падающей вниз по склону. Поверхность смещения при этом плоская или слабоволнистая, а ее положение предопределено строением склона. Движение этого типа оползней определяется наличием структурно ослабленных поверхностей, таких, как тектонические разрывы, трещины, напластования, и изменениями в сопротивлении сдвигу различных осадочных пород или на контакте прочных коренных и рыхлых пород. В отличие от предыдущего типа консеквентный оползень может неограниченно развиваться, если поверхность его смещения достаточно крутая и более или менее постоянная сдвигающая сила превышает сопротивление сдвигу.

К третьему типу относят инсеквентные оползни, которые секут поверхность напластования и простираются глубоко в склон. Здесь поверхность смещения, как правило, имеет сложное криволинейное очертание, ее положение определяется характером грунтов, слагающих толщу, и особенностями напластования пород.

Образуются оползни в различных породах в результате их нарушения равновесия или ослабления прочности. Вызываются как естественными, так и антропогенными причинами. Естественные: увеличение крутизны склонов, подмыв их основания морскими и речными водами, сейсмические толчки. Искусственные: разрушение склонов дорожными выемками, вырубкой леса, неразумное ведение сельского хозяйства на склонах. Согласно международной статистике, до 80 % современных оползней связано с деятельностью человека.

Классификация оползней

Классифицируются оползни: по масштабам явления, скорости движения и активности, механизму процесса, мощности и месту образования.

По масштабам: крупные, средние, мелкомасштабные.

Крупные вызываются, как правило, естественными причинами и образуются вдоль склонов на сотни метров. Их толщина достигает 10-20 и более метров. Оползневое тело часто сохраняет свою монолитность.

Средние и мелкомасштабные имеют меньшие размеры и характерны для естественных факторов образования.

Масштаб часто характеризуется вовлеченной в процесс площадью: грандиозные – 400 га и более, очень крупные – 200-400 га, крупные – 100-1200 га, средние 50-100 га, мелкие – 5-50 га и очень мелкие – до 5 га.

По глубине захвата склона выделяют мелкие (поверхностные) оползни и глубокие. Поверхность скольжения мелких оползней располагается в зоне сезонных колебаний влажности и температуры, а глубоких проходит в основном ниже этой зоны.

По скорости движения: скорость движения оползней может быть очень разная.

Характеристика движения Скорость

Крайне быстрое ................................... 3 м/с

Очень быстрое .................................... 0,3 м/мин

Быстрое ............................................... 1,5 м/сут

Умеренное ........................................... 1,5 м/мес

Медленное ........................................... 1,5 м/год

Очень медленное ................................. 0,06 м/год

Крайне медленное ............................... менее 0,06 м/год

С точки зрения проведения защитных мероприятий скорость движения оползней является важнейшей их особенностью.

По скорости оползни подразделяют на два типа, принципиально отличающихся друг от друга: постепенно или мгновенно оползающие. Скорость движения постепенно оползающих может быть от быстрой до крайне медленной; в этом случае еще до крупной подвижки можно заметить изменение рельефа и перекос сооружений и принять предупредительные меры.

Второй тип характеризуется мгновенным перемещением тела оползня с очень и крайне быстрой скоростью. Защита от таких оползней сложна и здесь большое значение имеет заблаговременный прогноз потенциально возможных смещений.

По активности. В зависимости от активности оползневого процесса выделяют действующие и недействующие оползни.

Действующие оползни имеют свежие и ярко выраженные, несглаженные эрозией формы поверхности. Деревья на склонах, затронутые такими оползнями, отклоняются от их первоначального положения («пьяный лес»).

Недействующие затухшие оползни обычно покрыты растительностью и нарушены процессами эрозии так, что следы последнего движения трудноразличимы. Но движение может возобновиться, если факторы, приводящие к возникновению оползня, продолжают существовать.

По механизму процессаподразделяются: на оползни сдвига, выдавливания, вязкопластические, гидродинамического выноса, внезапною разжижения. Часто имеют признаки комбинированного механизма.

По мощности процесса оползни делят на:

малые – обвал рыхлой массы до 10 тыс. м3;

средние – обвал грунта 100 тыс. м3;

крупные – обвал рыхлых масс 1000 м3;

крупнейшие – обвал более 1 тыс. м.3.

По месту образования они подразделяются на горные, подводные и искусственных земляных сооружений (котлованов, каналов, отвалов пород).

Следует иметь в виду, что огромное многообразие оползневых явлений обусловливает многочисленность их классификаций, поэтому выше приведены лишь те, которые в значительной мере оказывают влияние на выбор и обоснование основных инженерных мероприятий по стабилизации оползневых склонов. Вместе с тем в зависимости от региональных условий каждый тип оползня данного района обладает специфическими особенностями, которые необходимо принимать во внимание при проектировании.

Причины оползней

Природные Антропогенные
- крутизна склона, превышающая угол естественного откоса; - землетрясения; - переувлажнение склонов, подмыв - выветривание твердых пород; - наличие в толще грунта глин, песков, льда; - пересечение пород трещинами; - чередование глинистых и песчано-гравийных пород. - вырубка лесов, кустарников на склонах; - взрывные работы; - распахивание склонов; - чрезмерный полив садов на склонах; - разрушение склонов котлованами, траншеями; - заваливание мест выхода подземных вод; - строительство жилья на склонах.

Лавины

Cнежные лавины – это разновидность оползней Силы сцепления снега переходят определенную границу, и гравитация вызывает смещение снежных масс по склону. Снежный покров, лежащий на склоне гор, находится в состоянии неустойчивого равновесия. Силы сцепления внутри снежной толщи и на границе с земной поверхностью противодействуют силе тяжести, стремящейся сбросить снег к подножию склона. Свойства самой снежной толщи при этом непрерывно меняются как из-за смены метеорологической обстановки, так и под воздействием процессов, идущих внутри толщи снега. Новые снегопады и метели увеличивают вес снежных масс, резкие перепады температуры воздуха меняют величину напряжения пластов твердого снега, оттепели порождают интенсивное таяние, дожди ослабляют связи между частицами льда в снегу. Оседание и уплотнение снега увеличивают устойчивость снежного покрова на склоне, в то время как миграция водяных паров приводит к формированию горизонтов разрыхления.

Пришедшие в движение массы снега скользят по поверхности склона или низвергаются, проходя часть пути в свободном падении. Падение лавин сопровождается в зависимости от состояния снега оглушительным шумом и скрежетом. В отличие от обвалов скальных пород снежные обвалы обычно в процессе движения значительно увеличиваются за счет захвата новых слоев снега, лежащих ниже по склону. Скорость лавин может достигать 80—100 м/с, объем отложившихся масс снега одной лавины — 2—6 млн. м3.

Причины снежных лавин

Природные Антропогенные
- скопление различных модификаций снега, толщиной слоя 30-70 см; - сильные и продолжительные метели, снегопады; - крутые склоны (от 15° до 50°) длиной более 500м; - отсутствие лесного массива на склонах; - внезапные оттепели; - сдувание ветром снега с подветренного слоя и перенос его на гребень, образование карниза над наветренным склоном; - вырубка леса и кустарников на склонах; - нарушение травяного покрова нерегулярным выпасом скота; - взрывные работы; - использование сильных источников звука; - громкий крик.

Существует несколько классификаций лавин, в основу которых положены разные признаки: тип снега (рыхлый или плотный), содержание в снегу воды, характер движения, поверхность скольжения, морфология пути.

Однако общая классификация лавин должна отражать наиболее существенные их признаки и служить практическим целям организации защиты от лавин. Этим требованиям в наибольшей степени отвечают два подхода к подразделению лавин на главные типы. Первый генетический — исходит из учета причин схода лавин, о которых говорилось выше; ценность его состоит в возможности разработки прогноза наступления лавинной опасности. В основе второго подхода лежат учет рельефа снегосборного бассейна и пути движения лавины. Этот принцип подразделения лавинных аппаратов позволяет рассчитывать объемы и дальности выброса лавин, т. е. необходим при картировании лавиноопасных территорий. В данном пособии мы рассмотрим первый подход к классификации лавин.

Генетическая классификация лавин, наиболее полно разработанная советским исследователем В. Н. Аккуратовым, включает следующие классы и типы лавин.

I. Класс сухих (холодных) лавин.

Состоят такие лавины обычно из сухого снега; сходят преимущественно зимой; пути схода строго не ограничены — могут сходить по ровному склону и частично по воздуху. Они имеют максимальную скорость, могут образовать воздушную волну. К классу сухих относятся следующие типы лавин:

1. Лавины из свежевыпавшего снега. Такие лавины возникают из-за перегрузки склонов при продолжительных снегопадах. Для схода лавин достаточно 0,3—0,5 м свежего снега. В многоснежных районах умеренного климата этот тип лавин является основным.

2. Лавины из метелевого снега. Причина их возникновения — большая скорость роста составляющей силы тяжести на склоне. Это наиболее характерный тип лавин для районов с умеренно холодным климатом и бурным ветровым режимом.

3. Лавины, связанные с перекристаллизацией снега и образованием слоев глубинной изморози (силы сцепления в которых ослаблены). Обычно редкие, но мощные лавины.

4. Лавины температурного сокращения снежного покрова. Эти лавины возникают в результате резкого понижения температуры воздуха. Также редкий тип лавин.

II. Класс мокрых (теплых) лавин.

Формируются такие лавины из влажного или из мокрого снега; сходят они преимущественно весной; пути схода обычно постоянны; движение осуществляется по нижним горизонтам снега или по грунту; скорость движения меньше, чем у сухих лавин; воздействие связано главным образом с давлением тяжелых (пропитанных водой) масс снега.

1. Лавины, возникающие в результате радиационных оттепелей. Это маломощные лавины южных (солнечных) склонов.

2. Лавины, связанные с оттепелями и весенним снеготаянием, обычно состоят из влажного, реже мокрого снега. Поверхностью скольжения служит обычно поверхность раздела слоев снега, т.е. лавины относятся к категории пластовых.

3. Грунтовые лавины формируются весной из мокрого, полностью пропитанного водой снега, вследствие продолжительных оттепелей и дождей или при бурном снеготаянии во время фенов. Сходят всегда по определенным путям, поэтому, как правило, имеют названия. Переносят значительное количество обломочного материала. Грохот этих лавин жители Альп называют «лавинным громом». Наиболее разрушительные в классе мокрых лавин.

Лавины — одно из наиболее широко распространенных и опасных природных явлений горных стран. Упоминания о лавинах встречаются в сочинениях писателей древности, живших более 2000 лет назад. Древнегреческий историк Полибий (201 —120 г. до н. э.) пишет о потерях от лавин при переходе войск Ганнибала через Альпы (218 г. до н. э.). Древнеримский географ Страбон (63 г. до н. э. — 20 г. н. э.) писал о лавинной опасности, подстерегающей путешественника в Альпах и на Кавказе.

В январе 1951 г. в зоне лавинных катастроф оказалась вся Альпийская горная цепь длиной около 700 км и шириной до 150 км. Снегопад, сопровождавшийся буранами, продолжался во многих районах в течение семи дней и закончился резким потеплением. Количество выпавшего снега местами превышало годовую норму осадков в 2—3 раза и достигало 2— 3 м. Склоны оказались перегруженными снегом, и начался массовый сход лавин. Нарушилась вся транспортная сеть Альп — шоссейные и железные дороги были местами разрушены или завалены и временно закрыты. Лавины сошли в местах, где многие поколения жителей их не знали. Были уничтожены здания отелей, заповедные леса. Сезон получил название «Зима террора».

В феврале 1999 года лавина массой в 170 тыс. т полностью разрушила посёлок Гальтур в Австрии, вызвав гибель 30 человек, а в начале марта 2012 года серия лавин в Афганистане разрушила жилые дома, вызвав гибель не менее 100 человек.

В России снежные лавины распространены в горных районах Кавказа, Урала, в Восточной и Западной Сибири, Дальнем Востоке, на Сахалине.

В наши дни, многие страны накопили значительный опыт защиты от лавин.

Комплекс противолавинных мероприятийсостоит их двух основных категорий - профилактической и инженерной.

Профилактические мероприятия сводятся к предупреждению о лавинной опасности и ее ликвидации искусственным сбрасыванием. Для предупреждения лавинной опасности составляются карты лавиноопасных зон и прогноз времени схода лавин.

Профилактические мероприятия включают также оповещение населения о наступлении лавиноопасных периодов.

Искусственное сбрасывание лавин проводится минометами или подрывом взрывчатыми веществами площади лавиносбора. Лавиносборы обстреливают и для контроля, чтобы проверить устойчивость снега на склоне.

Инженерные мероприятия применяются обычно для защиты от лавин населенных пунктов и капитальных сооружений. Для этого строятся туннели, галереи, навесы. Обычно эти сооружения используются для прикрытия отдельных участков на железных, шоссейных дорогах, проходящих в горах.

Уже много лет возводились сооружения, изменяющие путь движения лавины, уменьшающие скорость и дальность выброса, - лавинорезы, клинья, направляющие стенки, обойные дамбы и др.

Они частично гасят энергию лавины или отводят ее от защищаемого объекта. Часто практикуются и такие инженерные методы, как террасирование, застройка склонов снегоудерживающими щитами. Они предупреждают соскальзывание снега из лавиносборов. Это дорогой, но эффективный способ борьбы с лавинами. Охрана и восстановление лесов на склонах гор по-прежнему считается одним из важнейших мероприятий в лавиноопасных районах. В Альпах лес, снесенный лавиной, немедленно восстанавливают. Посадку лесов обычно сочетают с застройкой склонов снегоудерживающими конструкциями.

Естественной защитой от лавин служит густой лес. Он препятствует перераспределению снега ветром, разделяет снежный покров на отдельные участки. В Швейцарии закон, запрещающий рубки леса на склонах гор, существует с XIV в. Уничтожение лесов на склонах гор всегда стимулирует лавинную деятельность.

Селевые потоки

Сель – бурный грязевый или грязекаменный поток, состоящий из смеси воды и обломков горных пород, внезапно возникающий в бассейнах небольших горных рек. Селевые создают угрозу населенным пунктам, железным и автомобильным дорогам и другим сооружениям, находящимся на их пути.

Непосредственными причинами зарождения селей служат ливни, интенсивное таяние снега, прорыв водоемов, реже землетрясения, извержения вулканов.

Классификация селей

Все если по механизму зарождения подразделяются на три типа:эрозионный, прорывной и обвально-оползневый.

При эрозионном вначале идет насыщение водною потока обломочным материалом за счет смыва и размыва прилегающего грунта, а затем уже формируется селевая волна. Такой сель возникает в результате интенсивных и продолжительных ливней, бурного таяния снега.

Прорывной характеризуется интенсивным процессом накопления воды, одновременно размываются горные породы, наступает предел и происходит прорыв водоема (озера, внутриледниковой емкости, водохранилища). Селевая масса устремляется вниз по склону или руслу реки.

При обвально-оползневом происходит срыв массы водонасыщенных горных пород (включая снег и лед). Насыщенность потока в этом случае близка к максимальной.

Каждому горному району свойственны свои причины возникновения селей. Например, на Кавказе они происходят главным образом в результате дождей и ливней (85 %).

В последние годы к естественным причинам формирования селей добавилисьтехногенные факторы, нарушение правил и норм работы горнодобывающих предприятий, взрывы при прокладке дорог и строительстве других сооружений, вырубки леса, неправильное ведение сельскохозяйственных работ и нарушение почвенно-растительного покрова.

При движении сель представляет собой сплошной поток грязи, камней и воды. Крутой передний фронт селевой волны высотой от 5 до 15 м образует «голову» селя. Максимальная высота вала водогрязевого потока иногда достигает 25 м.

В России до 20 % территории находится в селеопасных зонах. Особенно активно селевые потоки формируются в Кабардино-Балкарии, Северной Осетии, Дагестане, в районе Новороссийска, Саяно-Байкальской области, зоне трассы Байкало-Амурской магистрали, на Камчатке в пределах Станового и Верхоянского хребтов. Они также происходят в некоторых районах Приморья, Кольского полуострова и на Урале. Еще в 1966 г. на территории СССР было зарегистрировано более 5 тысяч селевых бассейнов. В настоящее время их количество возросло.

Классификация селей на основе причин возникновения приведена в табл. 16.

Таблица 16

Типы Первопричины Распространение и зарождение
1. Дождевой Ливни, затяжные дожди Самый массовый на Земле тип селей образуется в результате размыва склонов и появления оползней
2.Снеговой Интенсивное снеготаяние Происходит в горах Субарктики. Связано со срывом и переувлажнением снежных масс
3. Ледниковый Интенсивное таяние снега и льда В высокогорных районах. Зарождение связано с прорывом талых ледниковых вод
4. Вулканогенный Извержения вулканов В районах действующих вулканов. Самые крупные. Вследствие бурного снеготаяния и прорыва кратерных озер
5. Сейсмогенный Сильные землетрясения В районах высокой сейсмичности. Срыв грунтовых масс со склонов
б. Лимногенный Образование озерных плотин В высокогорных районах. Разрушение плотин
7. Антропогенный прямого воздействия Скопление техногенных пород. Некачественные земляные плотины На участках складирования отвалов. Размыв и сползание техногенных пород. Разрушение плотин
8. Антропогенный косвенного воздействия Нарушение почвенно- растительного покрова На участках сведения лесов, лугов. Размыв склонов и русел

На основе главных факторов возникновениясели классифицируютсяследующим образом: зонального проявления — главным фактором формирования являются климатические условия (осадки). Сход происходит систематически, пути движения относительно постоянны. Регионального проявления (главный фактор формирования — геологические процессы). Сход происходит эпизодически и пути движения непостоянны. Антропогенные — это результат хозяйственной деятельности человека. Происходят там, где наибольшая нагрузка на горный ландшафт. Образуются новые селевые бассейны. Сход - эпизодический.

Классификация по мощности (по перенесенной твердой массе):

1. Мощные (сильной мощности), с выносом более 100 тыс. м3 материалов. Бывают один раз в 5-10 лет.

2. Средней мощности, с выносом от 10 до 100 тыс. м3 материалов. Бывают один раз в 2-3 года.

3. Слабой мощности (маломощные), с выносом менее 10 тыс. м3 материалов. Бывают ежегодно, иногда несколько раз в году.

Классификация селевых бассейнов по повторяемости селей характеризует интенсивность развития или его селеактивность. По частоте схода селей можно выделить три группы селевых бассейнов:

- высокой селевой активности (с повторяемостью один раз в 3-5 лег и чаще);

- средней селевой активности (с повторяемостью один раз в 6-15 лет);

- низкой селевой активности (с повторяемостью один раз в 16 лет и реже).

Классифицируются сели также и по их воздействию на сооружения:

- маломощный — небольшие размывы, частичная забивка отверстий водопропускных сооружений.

- среднемощный — сильные размывы, полная забивка отверстий, повреждение и снос бесфундаментных строений.

- мощный — большая разрушительная сила, снос мостовых ферм, разрушение опор мостов, каменных строений, дорог.

- катастрофический — полное разрушение строений, участков дорог вместе с полотном и сооружениями, погребение сооружений под наносами.

Иногда применяется классификация бассейнов по высоте истоков селевых потоков:

- высокогорные: Истоки лежат выше 2500 м, объем выносов с 1 км2 составляет 15-25 тыс. м3 за один сель;

- среднегорные: Истоки лежат в пределах 1000-2500 м, объем выноса с 1 км2 составляет 5-15 тыс. м3 за один сель;

- низкогорные: Истоки лежат ниже 1000 м, объем выносов с 1 км2 менее 5 тыс. м3 за один сель.

Причины селей

Природные Антропогенные
- наличие на склонах песка, гальки, гравия; - наличие значительного объема воды (ливни, таяние ледников, снегов, прорыв озер); - крутизна склонов более 100; - землетрясения; - вулканическая деятельность; -обрушение в русло рек большого количества грунта (обвал, оползень); - резкое повышение температуры воздуха. - создание на склонах гор искусственных водоемов; - вырубка леса, кустарника на склонах; - деградация почвенного покрова нерегулярным выпасом скота; - взрывы, разработка карьеров; - нерегулируемый сброс воды из ирригационных водоемов на склонах; - неправильное размещение отвалов отработанной породы горнодобывающими предприятиями; - подрезка склонов дорогами; - массовое строительство на склонах.

Обвалы

Обвалы (горный обвал) — отрыв и катастрофическое падение больших масс горных пород, их опрокидывание, дробление и скатывание на крутых и обрывистых склонах.

Обвалы природного происхождения наблюдаются в горах, на морских берегах и обрывах речных долин. Они происходят в результате ослабления связанности горных пород под воздействием процессов выветривания, подмыва, растворения и действия сил тяжести. Образованию обвалов способствуют: геологическое строение местности, наличие на склонах трещин и зон дробления горных пород. Чаще всего (до 80 %) современные обвалы связаны с антропогенным фактором. Они образуются в основном при неправильном проведении работ, при строительстве и горных разработках.

Обвалы характеризуются мощностью обвального процесса (объемом падения горных масс) и масштабом проявления (вовлечение в процесс площади).

По мощности обвального процесса обвалы подразделяют на крупные (отрыв пород 10 млн м3), средние (до 10 млн м3) и мелкие (отрыв пород менее 10 млн м3).

По масштабу проявления обвалы подразделяются на огромные (100- 200 га), средние (50-100 га), малые (5-50 га) и мелкие (менее 5 га).

Кроме того, обвалы могут характеризоваться типом обрушения, которые определяются крутизной склона скатывания обвальных масс.

3.4.2. Инженерная подготовка оползневых территорий

Основными градостроительными задачами в отношении оползневых склонов являются:

- обеспечение стабильного состояния оползневого склона, т. е. сохранение равновесия всех действующих сил;

- создание условий для использования оползневого склона и прилегающих территорий в тех или иных градостроительных целях (застройка, парки и сады, дороги и т. д.).

Противооползневые мероприятия разделяются на профилактические и радикальные. Первые преследуют цели сохранения равновесия сил и некоторой стабилизации оползня, вторые устраняют в той или иной степени основные причины действия оползня, исключая его активизацию в будущем. Радикальные мероприятия устраняют основные причины возникновения и действия оползней, локальные же мероприятия задерживают или препятствуют движению оползня.

Профилактические мероприятия по борьбе с оползнями, как правило, легче выполнимы по сравнению с мероприятиями, осуществляемыми на том же участке при полном развитии оползневого процесса.

Решение вопросов инженерной подготовки территорий с оползневыми явлениями требует прежде всего исчерпывающих инженерно-геологических, гидрогеологических и гидрологических изысканий с последующим глубоким .анализом полученных материалов. При этом основными вопросами являются: - сущность явления и причины его возникновения; - границы распространения оползневых явлений вдоль склона и возможного влияния на территорию города; - характер происходящего движения (скольжения) оползня;

- прогноз проявления и действия оползня в перспективе.

В прогнозе предусматривается возможность движения оползня в силу изменяющихся причин, нарушения равновесия системы.

Изучение оползневого склона включает не только явление оползания, но и сопутствующие процессы оврагообразования, подтопления склона, движения подземных вод и т. д. Изучение этих явлений и процессов производится не только на оползневом склоне, но и на прилегающей территории.

При проектировании противооползневых мероприятий исходным материалом являются данные инженерных изысканий, в состав которых входят: - сбор и систематизация материалов, относящихся к исследованию оползневого участка; - изучение тела оползня с помощью геологосъемочных, геофизических, геодезических, буровых и других видов работ; - изучение свойств грунтов и режима подземных вод;

- наблюдения за движением оползня, включающие определение скорости и характера движения оползневой массы и установление причин активизации оползня.

Содержание и объем мероприятий по борьбе с оползнями обусловливаются причинами прохождения оползневого процесса. Противооползневые мероприятия многообразны и осуществляются, как правило, комплексно (рис. 45).

Рис. 45. Схема комплексных мероприятий по борьбе с оползневыми процессами на склоне морского берега

В условиях современного города всегда является целесообразным осуществление противооползневых мероприятий в полном комплексе и на всем протяжении берегового склона, если даже оползневые участки расположены с некоторыми разрывами между ними.

Основное требование при разработке мер защиты заключается в необходимости повысить коэффициент запаса устойчивости склона не ниже требуемого значения при всех возможных вариантах его параметров, от которых зависит стабильность. Проектировать начинают с анализа устойчивости склона, рассматривая состояние откоса в течение продолжительного периода, так как свойства грунтов и гидрогеологические условия могут меняться во времени. Такой анализ при освоении территории необходим не только на период строительства, но и эксплуатации. Устойчивость склонов оценивают, изучая как естественные откосы, так и искусственно созданные.

Выбор противооползневых мероприятий делают на основе технико-экономического сравнения вариантов.

В практике проектирования с оползневыми процессами борются комплексно, предусматривая меры профилактики на потенциально опасных склонах и радикальные на участках смещения горных пород. Одновременно устанавливают режим строительства и эксплуатации в зонах оползневых участков. Это запрещение подрезок в нижней части склона и подсыпок — в верхней, уничтожения растительности и распашки склонов, проведения нерегулируемого полива и сброса поверхностных вод. Накладывают ограничение на скорость движения транспорта по улицам прилегающей территории, разрабатывают специальные способы выполнения строительных работ.

Вертикальная планировка оползневых склонов

Вертикальную планировку потенциально опасного оползневого склона производят уполаживанием его до устойчивого состояния, а при большой высоте еще и террасированием, устраивая, так же как на овражных склонах, бермы с водоотводящими лотками. Одновременно склоны защищают от выветривания и размыва поверхностными водами, укрепляя их дерном или посевом многолетних трав.

Перераспределение земляных масс на склоне целесообразно производить за счет срезки верхней части и перемещения ее в нижнюю. На мелких оползнях улолаживание откоса или придание ему ломаного профиля могут быть эффективными стабилизирующими средствами на потенциально неустойчивых участках.

На мелких оползнях с выявленной поверхностью скольжения целесообразно устраивать упорные призмы (контрфорсы) из земляных масс, отсыпаемых в языковой части естественного склона (рис. 46, а), у подножья искусственной насыпи (рис. 46, б) или откоса выемки (рис. 46, в).

Контрфорсы проектируют так, чтобы увеличить удерживающие силы вблизи подошвы откоса до величин, обеспечивающих соответствующий коэффициент устойчивости. Параметры этих сооружений определяют расчетом, принимая во внимание профиль откоса и необходимую величину сопротивления сдвигу.

Рис. 46. Устройство грунтовых упорных призм: 1 - упорная призма; 2 — коренные породы; 3 — поверхность скольжения; 4 — первоначальная поверхность склона; 5 — насыпь из зернистого грунта; 6 — то же, из легкого материала; 7 — отметка до реконструкции насыпи; 8 — проектная отметка поверхности; 9 — ил, глина с органическими остатками; 10 — лоток водоотвода; 11— дренаж

Нормальная работа любого подпорного сооружения зависит от его способности сопротивляться опрокидыванию и скольжению, сдвигу по контакту или ниже его с вовлечением основания. На опрокидывание рассчитывают, рассматривая упорную призму (контрфорс) как гравитационное сооружение с распределением сил, обеспечивающим соответствующее направление равнодействующей. Аналогичным образом контрфорс рассчитывают на сдвиг по контакту или ниже его с определением необходимой глубины заложения основания. Проверочные расчеты проводят в нескольких поперечных сечениях на разных отметках глубины, чтобы определить прочность упорной призмы на сдвиг.

Для снижения сдвигающих сил в искусственно созданной насыпи автомобильных дорог производят ее реконструкцию, частично заменяя грунт насыпи более легким (рис. 46, б), например котельным шлаком или ракушечником. В последнее время для уменьшения массы насыпи применяют полистирольные блоки и плиты. Во всех случаях сооружение пригрузочных насыпей сопровождают защитой от поверхностных, а при необходимости и подземных вод.

Page 25

На городских территориях берегоукрепление проектируют с учетом технических и экономических требований, но особое значение придают эстетическим, поскольку набережные являются одним из доминирующих элементов городской среды.

Наиболее капитальным и обладающим высокими архитектурными свойствами является вертикальный тип в виде набережной стенки (рис. 39, а). Высокая стоимость такого типа берегоукрепления ограничивает его применение лишь условиями размещения в пределах плотной застройки и особой технической необходимости. Поэтому вертикальные стенки проектируют в центральных районах крупных городов и на особо ответственных участках реки. В остальных случаях устраивают откосные берегоукрепления, которые по сравнению с предыдущим типом отличаются простотой и невысокой стоимостью (рис. 39, б).

Рис. 39

Поперечный профиль береговой полосы проектируют по различным схемам в зависимости от ее градостроительного использования, рельефа местности и особенностей водоема.

По архитектурным требованиям высоту набережной ограничивают 5-6 м, поэтому, когда по условиям береговой полосы или уровенного режима необходима более высокая стенка, переходят на двухъярусный поперечный профиль (рис. 39, в). Городские набережные ограждают парапетами, железобетонными или металлическими решетками. Высоту ограждений принимают в пределах 0,9-1 м. Поверхность набережных облицовывают из камней морозостойких и невыветривающихся пород, но иногда оставляют в бетоне, учитывая при этом требования эстетики берегоукрепления.

Конструкции набережных

Конструкции набережных — стенок можно разделить на два основных типа: гравитационные и свайные. Набережные первого типа проектируют в виде массивной подпорной стенки или уголковой, более легкой конструкции. По экономическим соображениям область их применения ограничена основаниями, сложенными из прочных пород, затрудняющих внедрение свай.

Свайные набережные располагают на любых основаниях, кроме скальных, но чаще их используют в грунтах песчаных или глинистых. Описываемые конструкции состоят из тонких подпорных стенок (больверков) и свайных ростверков. Безанкерные больверки являются простейшим типом вертикального крепления берега. Свободная их высота (расстояние от дна водоема до верха стенки) обычно не превышает 3-4 м. При использовании в конструкции экранирующих и разгружающих устройств свободная высота стенки на благоприятных грунтах основания может быть повышена до 4,5-6 м.

При такой высоте рационально использовать заанкерованные конструкции больверков, что объясняется возможностью появления деформации в безанкерные стенках, особенно при размещении рядом с ними транспортных путей.

Низкие свайные ростверки широко используют в конструкциях городских набережных на реках и каналах, обнажающихся при низких уровнях водоема практически по всей высоте. Свободная высота набережных такого типа не превышает 5 м.

Рис. 40. Конструкции берегоукрепления:

1 — свайное поле; 2 — ростверк; 3 — вертикальная навесная панель; 4 — глухой парапет; 5 — монолитная стенка; 6 — дренаж; 7 — дренажный выпуск; 8 — каменная отмостка; 9 —песок; 10 — облицовка из камня; 11 — сборная стенка; 12 — илистые отложения; 13 — скальный грунт

Высокие свайные ростверки имеют много конструктивных разновидностей. Одна из наиболее распространенных показана на рис. 40, а. Ростверк, расположенный над горизонтом межени, устраивают без предварительного водоотлива, что объясняет широкое использование этой конструкции в городских набережных. Вертикальные усилия воспринимают сваи и шпунт, а горизонтальные — вертикальный навесной блок, являющийся одновременно ограждающей конструкцией.

Гравитационные стенки на естественном основании, изображенные на (рис. 40, б, в), устраивают, как правило, предусматривая предварительное возведение оградительных перемычек и водоотлива, что необходимо для выполнения строительных работ. В зоне водохранилищ такие стенки возводят до его заполнения водой или в период «сработки» уровня. Конструкции массивных монолитных бетонных и выложенных из камня (рис. 40, г) стенок применяют редко из-за того, что они не удовлетворяют современным требованиям индустриальности, но эти конструкции издавна использовали в портовом строительстве, речных и морских берегоукреплениях. Волноотбойные стенки устраивают обычно из массивного бетона с защищаемой от истирания лицевой гранью. Наружное очертание стенки принимают закругленной формы, обеспечивающей отбрасывание волновых всплесков в сторону моря.

Гравитационные стенки уголкового типа отличаются легкостью конструкции по сравнению с массивными (рис. 40, д и e). Их удерживают в устойчивом состоянии преимущественно за счет массы грунтовой засыпки, прижимающей горизонтальную часть уголка.

Конструкцию берегоукрепления рассчитывают на устойчивость и прочность, учитывая постоянные и временные нагрузки и воздействия, руководствуясь рекомендациями СНиПа.

Рассмотренные выше конструкции свайных и гравитационных набережных-стенок естественно не исчерпывают все многообразие существующих, что объясняется разнообразием конкретных условий проектирования. Вместе с тем, они дают представление о принципиальных конструктивных решениях стенок, подробные сведения о которых изложены в специальной литературе .

Page 26

Поверхность территории надлежит повышать:

- для освоения под застройку затопленных, временно затапливаемых и подтопленных территорий;

- для использования земель под сельскохозяйственное производство;

- для благоустройства прибрежной полосы водохранилищ и других водных объектов.

Варианты искусственного повышения поверхности территории необходимо выбирать на основе анализа следующих характеристик защищаемой территории: почвенно-геологических, зонально-климатических и антропогенных; функционально-планировочных, социальных, экологических и других, предъявляемых к территориям под застройку.

Проект вертикальной планировки территории с подсыпкой грунта следует разрабатывать с учетом плотности застройки территории, степени выполнения ранее предусмотренных планировочных работ, классов защищаемых сооружений, изменений гидрологического режима рек и водоемов, расположенных на защищаемой территории с учетом прогнозируемого подъема уровня грунтовых вод.

При защите территории от затопления подсыпкой отметку бровки берегового откоса территории следует принимать не менее чем на 0,5 м выше расчетного уровня воды в водном объекте с учетом расчетной высоты волны и ее наката.

Отвод поверхностного стока с защищенной территории следует осуществлять в водоемы, водотоки, овраги, в общегородские канализационные или ливневые системы.

При осуществлении искусственного повышения поверхности территории необходимо обеспечивать условия естественного дренирования подземных вод. По тальвегам засыпаемых или замываемых оврагов и балок следует прокладывать дренажи, а постоянные водотоки заключать в коллекторы с сопутствующими дренами.

Осуществлять работы по искусственному повышению поверхности территории путем отсыпки грунта или намыва.

Проект намыва грунтов разрабатывается организацией, проектирующей возведение сооружений из грунтовых материалов способами гидромеханизации на основе проекта инженерной подготовки территории к строительству;

- генерального плана города или плана детальной планировки микрорайона;

- генерального плана строительства промышленного объекта или проекта застройки территории отдельными сооружениями.

При расположении проектируемой намывной территории на берегах рек, естественных водоемов и водохранилищ или в их акватории отметки поверхности намываемого массива устанавливаются, исходя из требования защиты территории от затопления и подтопления при максимальных расчетных уровнях высоких вод.

Превышение отметок поверхности намывной территории над этими уровнями (с учетом высоты волны и ее нагона в водохранилище) должно быть не менее 1 м. При этом дополнительно следует учитывать удаленность зданий и сооружений от береговой линии; характер подземных сооружений и коммуникаций; минимально допустимую глубину нахождения подземных вод под сооружениями, а также наличие системы инженерной защиты (дамбы, дренажи и др.), предусмотренной проектом.

Для намыва, как правило, следует использовать естественные песчаные грунты. Вместе с тем с учетом назначения и зональности намыва, а также местными природно-техническими условиями, допускается частичное использование грунтов иного вида (крупнообломочных, пылеватых и глинистых, в том числе из вскрыши карьеров, и техногенно-образованных - золы, шлаки и др.), если они отвечают требованиям, предъявляемым к данной категории намывной территории.

В проекте, а также в выпускаемых на его основе Технических условиях на ведение намыва, должна быть учтена специфическая способность намывных грунтов уплотняться и упрочняться во времени.

Основные проектные решения по намыву должны быть в максимальной мере взаимоувязаны с инженерно-геологическим районированием территории; генеральным планом ее застройки; расчетными параметрами режима водохранилищ и рек, а также намечаемой системой мероприятий по инженерной защите территории от затопления, подтопления и опасных геологических процессов, предусмотренных проектом ее строительного освоения.

При наличии соответствующих указаний Технического задания в проекте прорабатываются следующие решения:

- намыв площадного дренажа из крупнообломочных грунтов или крупных и средней крупности песков на участках распространения слабофильтрующих грунтов во избежание образования техногенной верховодки в массиве (толще) намывных грунтов и для ускорения процесса их консолидации;

- намыв избыточных толщ песков до проектной отметки намывной территории для дополнительной консолидации подстилающих, сильносжимаемых глинистых и биогенных грунтов;

- устройство средствами гидромеханизации дренажных прорезей с замывом их хорошо дренирующим материалом для ускорения консолидации сильносжимаемых грунтов и уменьшения опасности подтопления намывной территории;

- экранирование подстилающих грунтов, загрязненных промстоками, путем намыва на них слоя глинистых грунтов;

- намыв противосуффозионного экрана из пылевато-глинистых грунтов при наличии поверхностных форм карстово-суффозионных проявлений для их исключения после создания намывной территории, а также замыв карстовых воронок и понижений в рельефе;

- удаление в необходимых случаях торфов и слабых грунтов, а также илов на дне замываемых водоемов для исключения значительных и длительных осадок намывного основания; неблагоприятных условий формирования свойств намывных грунтов, а также для исключения затруднений в их искусственном уплотнении, особенно в тех случаях, когда проектом не предусматривается прорезка этих грунтов сваями.

Намыв грунтов в районах распространения закарстованных грунтов на просадочные грунты (в грунтовых условиях 1-го типа просадочности), а также на набухающие, засоленные и загрязненные промстоками грунты допускается только при соответствующем обосновании.

При использовании песков, как наиболее распространенного грунтового материала для намыва, необходимо определять следующий комплекс характеристик:

компонентный состав (минеральный, химический, биологический);

гранулометрический состав;

степень гранулометрической неоднородности песчаных грунтов (с определением комплекса показателей, регламентируемых нормативными документами для намывных грунтов);

- морфологию частиц песчаной размерности (угловатость, сферичность, шероховатость или общую обработанность);

- предельные плотности сложения (минимальную и максимальную плотности сухого песка);

- показатели влагоемкости (максимальную, молекулярную, капиллярную);

- оптимальную влажность уплотнения;

- коэффициент фильтрации и степень фильтрационной анизотропии, определяемой при фактической плотности намытых грунтов, с учетом изменения ее во времени.

cyberpedia.su

Серебрение по Морозову. Микроскопическая картина

Техника. См. выше.

Микроскопическая картина. Спирохеты окрашиваются в буро-черный цвет (рис.22).

Для негативной окраски спирохет используют несколько методов.

Негативный метод Бурри

Техника. См. выше.

Микроскопическая картина. На темно-сером тушевом фоне – бесцветные клетки.

Негативная окраска колларголом

Этот метод отличается простотой, доступностью и хорошей эффективностью.

Техника. На фиксированный мазок наливают на 3 минуты 2% раствор колларгола. После этого препарат ставят в наклонное положение (водой не смывают) и подсушивают.

Микроскопическая картина. На золотисто-оранжевом фоне отчетливо контурируется бесцветная спирохета.

Негативный метод Бурри

Техника. См. выше.

Микроскопическая картина. На темно-сером тушевом фоне – бесцветные клетки.

Окраска простейших

Метод Романовского-Гимза

Техника. См. выше.

Микроскопическая картина. Клеточная цитоплазма окрашивается в голубой цвет, а ядра клеток и жгутики – в красно-фиолетовый цвет (рис.23).

Метод Райта

Техника.

Реактивы. Способ приготовления: 1% раствор щелочного метиленового синего на 0,5% растворе двууглекислого натрия наливают в сосуд таким образом, чтобы высота слоя жидкости не превышала 6 см, и нагревают при 100° С в течение часа. Затем жидкость охлаждают и фильтруют. Охлажденный фильтрат в тонком слое при искусственном освещении должен иметь пурпурно-красный оттенок. К 100 мл фильтрата добавляют 500 мл 0,1% водного раствора эозина. При смешивании обеих жидкостей образуется обильный осадок; последний отфильтровывают и высушивают. Полученный таким образом краситель растворяют в ступке в метиловом спирте в соотношении 0,1:60,0.

На сухой нефиксированный мазок наливают несколько капель красителя. Спустя 1 минуту прибавляют столько же капель дистиллированной воды. Через 2-3 минуты препарат промывают в воде около 0,5 минуты, пока он в тонком слое не приобретет розоватого оттенка.

Микроскопическая картина. Ядра простейших окрашиваются в вишнево-красный цвет, цитоплазма – в голубоватый, жгутики – в красный цвет.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Page 2

Техника.

Реактивы. 1) Жидкость Шаудина: делают смесь 1 объема 96° этилового спирта с 2 объемами насыщенного раствора сулемы; к этой смеси непосредственно перед употреблением приливают ледяную уксусную кислоту в количестве 3-5% к общему объему. Смесь употребляют слегка нагретой (до появления паров). 2)Спирт этиловый 70-96°. 3) Спирт-йод – 70° этиловый спирт, к которому добавлена настойка йода до красноватого цвета. 4) Железо-аммониевые квасцы, 2,5-4% водный раствор. 5) Раствор гематоксилина: 1 г кристаллического гематоксилина растворяют в 10 мл 96° этилового спирта и доливают до 100 мл дистиллированной водой: настаивают на свету при комнатной температуре 2-3 недели.

Жидкость Шаудина наносят на нефиксированный мазок на 2-5 минут. Затем мазок помещают в 70° этиловый спирт на 2 минуты, смесь этилового спирта с йодом на 2 минуты и снова в этиловый спирт на 2 минуты. Мазок промывают дистиллированной водой в течение 2 минут и помещают в раствор железо-аммониевых квасцов на сутки. Через сутки мазки быстро ополаскивают дистиллированной водой, дают стечь воде и переносят в раствор гематоксилина на сутки. После этого мазки промывают водопроводной водой в течение 5 минут и далее дифференцируют 2% раствором квасцов.

Дифференцирование является наиболее трудным моментом. Его цель – удаление излишка краски для выявления структуры простейших. Оно проводится под контролем микроскопа. С препарата осторожно удаляют осадок краски и наливают раствор квасцов. Дифференцирование прекращают, когда протоплазма отдаст излишек краски, и появятся четкие контуры клеток. После этого препарат промывают проточной водой и подсушивают.

Микроскопическая картина. На серо-лиловом фоне цитоплазмы клеток отчетливо видны черные хроматиновые элементы ядер.

Окраска йодом и йод-эозином

Используется для окраски нативных мазков амеб и их цист.

Техника. Для приготовления мазка используют раствор Люголя, приготовленный следующим образом: в 100 мл дистиллированной воды сначала растворяют 2 г йодистого калия, а затем 1 г кристаллического йода. Жидкость хранят в склянке темного стекла.

Йод-эозин (по Дональдсону): смешивают равные объемы насыщенного раствора кристаллического йода в 5% водном растворе йодистого калия и насыщенного водного раствора желтого (водорастворимого) эозина.

Микроскопическая картина. Цисты и вегетативные клетки приобретают четкие контуры коричневого оттенка.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Page 3

Используется для выявления амеб и их цист.

Техника. См. выше.

Микроскопическая картина. На темно-сером тушевом фоне видны бесцветные клетки и цисты (рис.24).

Микроскопическое исследование актиномицетов

Простые методы окраски (см. выше)

Техника. См. выше.

Микроскопическая картина. Клетки приобретают цвет примененного красителя (рис.25).

Метод Грама

Техника. См. выше.

Микроскопическая картина. Клетки окрашиваются грамположительно (в сине-фиолетовый цвет).

Микроскопическое исследование патогенных грибов

Исследуемый материал помещают на предметное стекло в каплю 10-20% едкой щелочи (или смеси спирта с глицерином), закрывают покровным стеклом и исследуют сразу после приго­товления и через 20 минут (рис.26).

Основные красители

Наиболее часто применяемые в микологической практике красители для контрастного окрашивания мицелия – метиленовый синий, метиловый фиолетовый, генциановый фиолетовый, раствор Люголя.

Метиленовый синий применяют в виде спиртовых, водных, щелочных растворов: 1) спиртовый раствор: к 100 мл 96%-ного спирта добавляют 3 г краски, взбалтывают, оставляют отсто­яться на несколько суток, фильтруют; перед употреблением разводят в 5-10 раз; раствор прочный; 2) водный раствор: к 100 мл воды добавляют 2 г краски, отстаивают 2 суток; перио­дически взбалтывают.

Окраска метиленовым синим

Техника. На зафиксированный мазок наносят водно-спиртовый раствор метиленового синего на 5-10 мин.

Микроскопическая картина. Клетки окрашиваются в синий цвет (рис.27)

Дифференциальное окрашивание мицелия

Техника. Готовят смесь Судана 3, хлопчатобумажного синего и йода в молочной кислоте (1:1:1).

Микроскопическая картина. В гифах жир окрашивается в ярко-оранжевый цвет, гликоген – в буро-красный, а прото­плазма – в синий.

Окрашивание амилоидной оболочки

Применяют для большин­ства сумчатых и несовершенных грибов.

Техника. Краси­тель – раствор Люголя. Несколько капель раствора добавляют к готовому препарату на предметное стекло. Время окрашивания от нескольких секунд до 1 часа.

Микроскопическая картина. Амилоидные оболочки окраши­ваются в синий цвет.

Окрашивание клеточной оболочки

Метод Пешкова

Применяют для дрожжей и низших грибов.

Техника. Препарат фикси­руют в жидкости Карнуа и опускают на 2-5 мин в 10%-ный рас­твор танина, тщательно промывают и красят фуксином Пфейффера в течение 30-60 секунд, не промывая микроскопируют.

Микроскопическая картина. Оболочки ок­рашиваются в синеватые цвета.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Page 4

Применяют для всех видов грибов.

Техника. Препарат фиксируют любым спо­собом, помещают в 0,5%-ный водный раствор генцианового фио­летового на 1,5-2 мин, промывают, помещают в 0,5%-ный водный раствор конго красного на 2-3 мин, промывают, подсушивают.

Микроскопическая картина. Оболочки окрашиваются в темно-синий или черный цвет

Окрашивание хитиновых веществ

Метод Висселинга

Техника. Препарат кипятят в концентрированной щелочи в течение часа, промывают, нейтрализуют серной кисло­той до получения нейтральной реакции. Затем добавляют две капли раствора йода в йодистом калии и несколько капель раз­веденной серной кислоты.

Микроскопическая картина. Хитин окрашивается в ярко-фиолето­вый цвет.

Определение хитина и хитозана в мицелии

Техника. Отфильтрованный мицелий помещают в аппарат Сосклета для удаления жира эфиром и, если надо, пигмента. Пигмент удаляют спирто-бензолом (1:4) затем отмывают до полного исчезновения спирто-бензола, заливают 4-5%-ным едким натром и кипятят в водяной бане 3-4 ч, после чего проверяют на белок биуретовой реакцией.

Для этого к 5-6 мл раствора добавляют такое же количество 10%-ного раствора щелочи, хорошо взбалтывают, после чего добавляют 2-3 капли 3%-ного раствора сернокислой меди и слабо нагревают; белок окрашивается в фиолетовый цвет.

Если реакция отрицательная, то мицелий отмывают от щелочи до нейтральной реакции и обра­батывают 50%-ным едким натром при 140°С в течение 1-2 ч. Проверяют наличие хитозана качественной реакцией со слабым раствором йода; хитозан окрашивается в фиолетовый цвет.

Да­лее препарат заливают 1-2%-ной уксусной кислотой, в которой хитозан растворяется. После окончательного растворения хито­зана, о чем судят по исчезновению фиолетовой окраски, оста­ется хитин, который окрашивается слабым раствором йода в ин­тенсивный коричневый цвет. Для количественного определения полученный материал заливают абсолютным спиртом на 2-3 ч, высушивают в вакууме при 40°С и гидролизуют концентрированной соляной кислотой. Затем определяют количество редуцирующих сахаров (методом Хагедорна-Йенсена).

Окрашивание ядерного аппарата

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Page 5

Техника. Препарат фиксируют жид­костью Карнуа в течение 10-30 мин, промывают 80%-ным спиртом и проводят через нисходящие концентрации спиртов. Реакция проявляется только в гидролизованном материале. Последова­тельность гидролиза: препарат помещают на 2-3 мин в 1 N pаствор соляной кислоты при комнатной температуре, затем на 5-6 мин в 1 N pаствор соляной кислоты, нагретой до 60°С, и снова в первый раствор на 1-2 мин, затем помещают в реактив Шиффа на 2-3 ч. Реактив Шиффа готовят следующим образом: 0,5 г основного фуксина растворяют в 90 мл кипящей дистиллирован­ной воды, охлаждают до 50°С, фильтруют и прибавляют 3 мл кон­центрированной соляной кислоты. Отдельно в 10 мл холодной воды растворяют 2 г безводного или 4 г кристаллического сульфата натрия. Полученный раствор сульфата приливают к раствору фуксина, охлажденному до 25°С.

Второй способ приготовления раствора Шиффа: 1 г основного фуксина для фуксинсернистой кислоты растворяют в 200 мл кипя­щей дистиллированной воды, охлаждают до 50°С, фильтруют и до­бавляют 20 мл 1 N cоляной кислоты, охлаждают до 25°С и до­бавляют 1 г метабисульфита натрия или калия. Реактив хранят на холоду в широкой склянке с притертой пробкой. Реактив считается пригодным, пока он сохраняет запах сернистого газа и цвет бледного чая (розовая окраска является цветом непри­годности).

Препарат промывают по 15-20 мин в трех порциях сернистых вод и затем в дистиллированной воде. Способ приготовления сернистых вод: 1) к 200 мл дистиллированной воды добавляют 4 мл концентрированной соляной кислоты; отдельно в 25 мл дис­тиллированной воды растворяют 4 г безводного или 8 г кри­сталлического сульфата натрия, приливают этот раствор к подкисленной воде, взбалтывают и дают отстояться или 2) 0,5 г метабисульфита натрия или кали, 5 мл 1н. соляной кислоты по­мещают в колбу и доводят объем раствора до 100 мл дистилли­рованной водой. Для получения более контрастных препаратов их докрашивают 0,1-0,25%-ным раствором, лучше слабо подкисленным, светло-зеленого или водного голубого (вассерблау). Препарат промывают водой, высушивают, проводят через ряд спиртов восходящей концентрации до абсолютного, ксилол и по­мещают в бальзам.

Микроскопическая картина. Ядерные элементы окрашиваются в красно-фиолетовый цвет, протоплазма при докрашивании приобретает зеленый оттенок. Лучше всего окрашиваются конидии несовер­шенных грибов.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Page 6

Техника. Препарат фиксируют любым способом, помещают на 5-12 ч в 1%-ный раствор сафранина, который готовят смешиванием 1%-ного раствора водорастворимого сафранина и воды (1:1); про­мывают в воде, затем в спирте, снова трехкратно в воде по 15 мин, затем помещают в 2%-ный водный раствор генцианового фиолетового на 30 мин, промывают водой и помещают в 1%-ный водный раствор оранжа на 1-3 мин, после чего промывают в гвоздичном масле.

Микроскопическая картина. Протоплазма окрашивается в розовый цвет, ахроматиновые элементы клетчатки – в фиолетовый, хроматино­вые структуры – в красный.

Окрашивание гематоксилином Делафильда

Техника. Препарат фикси­руют 35-50%-ным спиртом и помещают в краситель, для изготов­ления которого 1 г гематоксилина растворяют в 6 мл абсолют­ного спирта и этот раствор вливают по каплям в 100 мл насы­щенного водного раствора аммонийных квасцов и оставляют сто­ять в течение недели, затем прибавляют по 25 мл глицерина и метилового спирта и фильтруют через 4 ч. Время окрашивания 3-30 мин. Препарат промывают в нескольких сменах воды 5-30 мин. Для дифференциации структур клетки к воде или спирту добавляют соляную кислоту (1 капля на 100 мл воды); После чего промывают 70%-ным спиртом и водой.

Микроскопическая картина. Ядра окрашиваются в красный цвет, протоплазма в фиолетовый.

Окрашивание гематоксилином и эозином (или эритрозином)

Техника. Препарат окрашивают гематоксилином Делафильда и дифференци­руют подкисленным спиртом. Срезы объекта погружают в 1%-ный спиртовой раствор эозина (или эритрозина) на 1-2 мин, прово­дят через крепкие спирты, промывают как обычно.

Микроскопическая картина. Ядро и клет­чатка окрашиваются в пурпурный цвет, протоплазма – в розо­вый. Особенно хорошо окрашиваются ржавчинные грибы.

Окрашивание борным кармином

Применяется при изучении ядер, хромосом и т.д.

Техника. В 100 мл воды, нагретой до 50°С, рас­творяют 4 г буры, добавляют 3 г кармина, а потом доливают 100 мл 70%-ного спирта и фильтруют. Препарат фиксируют любым способом, промывают, обезвоживают до 50% проводкой через спирты, погружают в краситель на 1-3 дня, промывают 70%-ным спиртом, подкисленным 1-2 каплями соляной кислоты, 2-3 дня.

Микроскопическая картина. Ядра окрашиваются в яркий розовый цвет.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Page 7

Особенно хорошо окрашива­ются ядра в гифах несовершенных грибов.

Техника. Препарат фиксируют метиловым спиртом, смесью спирта с формалином или жидкостью Карнуа по следующей схеме: Фиксация жидкости Карнуа 10 мин; промывка в 96%-ном спирте; выдерживание в 70%-ном спирте 30 мин; промывка в дистиллированной воде; выдерживание в холод­ной соляной кислоте 6 мин; гидролиз 4-6 мин при 60°С; про­мывка в холодной 1 н. соляной кислоте и дистиллированной воде; выдерживание 15 мин в буферном растворе (фосфатный бу­фер, pH 6,9), затем 30-40 мин в растворе Гимза (исходный раствор и буфер (1:1) готовят непосредственно перед употреб­лением).

Приготовление раствора Гимза: 3,8 г азурэозина раство­ряют в 125 мл глицерина при 60°С, добавляют 395 мл метилового спирта и фильтруют.

Микроскопическая картина. Ядра окрашиваются в синий цвет. При мик­роскопировании препарат помещают в глицерин.

Микроскопия вирусов

Как известно, вирусы не могут быть рассмотрены в свето­вом микроскопе, поэтому в световом микроскопе изучают включения или ткани, пораженные вирусом. Изменения, проис­ходящие в тканях, изучают с помощью методов и приемов гис­тологического исследования, которые рассматриваются в соот­ветствующих руководствах.

Препараты для микроскопирования элементарных телец и включений готовят из мазков и отпечат­ков органов и тканей. Подготовленные мазки немедленно фиксируют. С этой целью применяют простые и сложные фиксаторы. Среди простых чаще других употребляют метиловый спирт, смесь Никифорова (спирта и эфира поровну), ацетон. Среди сложных фиксаторов нашли применение следую­щие: 1) смесь Дюбоска-Бразиля-Буэна: пикриновой кислоты 1 г, имеющегося в продаже (40%) формалина 60 мл, спирта (80%) 150 мл и ледяной уксусной кислоты 15 мл; 2) сулемовые смеси: а) Шаудина: насыщенного раствора сулемы 2 части и абсолютного спирта 1 часть; б) Ценкера: сулемы 5 г, бихро­мата калия 2,5 г, сульфата натрия 1 г, ледяной уксусной ки­слоты 5 мл, дистиллированной воды 100 мл. Уксусную кислоту добавляют в смесь перед употреблением; в) Хелли-Макси­мова: сулемы 5 г, бихромата калия 2,5 г, имеющегося в про­даже неразведенного формалина 10 мл, 2% раствора осмиевой кислоты 10 мл, дистиллированной воды 100 мл. Формалин и ос­миевую кислоту добавляют смесь перед употреблением.

Окраска препаратов

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Page 8

Техника. Нефиксированный препарат по­мещают в краситель, приготовленный следующим образом: насы­щают кармином 45%-ный (по объему) раствор уксусной кислоты при температуре кипения; после остывания, отстаивания и фильтрации на каждые 100 мл раствора прибавляют 1-2 капли 1-5%-ного раствора уксуснокислого железа. Время окрашивания – 1-24 ч.

Микроскопическая картина. Ядра окрашиваются в яркий розовый цвет.

Окрашивание пирокармином

Техника. Препарат фиксируют спиртом, промывают водой и помещают в краситель, приготовленный сле­дующим образом: 1 г кармина растворяют в 50 мл воды с 50 мл крепкого аммиака, добавляют 50 мл насыщенного раствора пик­риновой кислоты и оставляют в растворе красителя на 2-3 дня, затем фильтруют.

Микроскопическая картина. Ядра окрашиваются в яркий розовый цвет.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Page 9

Окраска по Романовскому-Гимза является одним из ос­новных методов при изучении морфологии риккетсий, хламидий, спиро­хет, простейших, а также при исследовании форменных элементов крови.

Техника. Краситель Романовского-Гимза состоит из азура, эозина и метиленового синего. Непосредственно перед упот­реблением к 10 мл дистиллированной воды нейтральной реакции прибавляют 10 капель краски и тотчас же наливают на препа­рат, предварительно фиксированный жидким фиксатором, на один час. Затем краску сливают, препарат промывают водой, высуши­вают на воздухе и микроскопируют. Окрашивание происходит бы­стрее (30-40 минут), если препарат с краской поместить в термостат при 37°С. К 10 мл дистиллированной воды нейтраль­ной или слабо щелочной реакции непосредственно перед окра­ской препарата прибавляют 10 капель краски и тот час же на­ливают на фиксированный препарат (или погружают препарат в стаканчик с краской). Через 1 час краску сливают, препарат промывают водой, высушивают на воздухе и исследуют. Если по­местить препарат с краской в термостат при 37º, то окрашива­ние происходит быстрее (30-40 минут).

Результаты окрашивания зависят от свойства воды, поэтому следует проверять ее реакцию.

Микроскопическая картина. Риккетсии окрашиваются в ро­зово-красный цвет, ядра эукариотических клеток – в красно-фиолетовый, а цитоплазма – в голубой.

Метод Здродовского

Техника. Препарат тонким слоем наносят на стекло, фик­сируют на пламени и окрашивают разведенным карболовым фуксином (10-15 капель фуксина на 10 мл дважды дистиллиро­ванной воды) в течение 5 минут; затем препарат слегка обес­цвечивают погружением на 1-3 секунды в слабую (0,01%) соля­ную кислоту, промывают водой и докрашивают в течение 30 секунд 1% раствором водного метиленового синего. Тонкий мазок фиксируют на пламени горелки. Окраску производят разведенным карболовым фуксином (10-15 капель фуксина на 10 мл дис­тиллированной воды) в течение 5 минут. Окрашенный препарат промывают водой, а затем обесцвечивают в растворе органиче­ской или минеральной кислоты (0,5% лимонная кислота, 0,01% соляная кислота) в течение 2-3 секунд. Затем препарат про­мывают водой и докрашивают 0,5% раствором метиленовой синьки в течение 0,5 минуты.

Микроскопическая картина. Риккетсии окрашиваются в ру­биново-красный цвет, в то время как клетки хозяина обес­цвечиваются кислотой и дополнительно окрашиваются в голубой (протоплазма) или синий (ядра) цвет (рис.20).

Окраска хламидий

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Page 10

Техника (см. выше).

Микроскопическая картина. На разных стадиях развития способность воспринимать окраску у хламидий меняется:

- “Элементарные тельца” (инфекционные частицы) окрашива­ются краской Гимза в пурпурный цвет.

- “Первоначальные тельца” (неинфекционные частицы) окра­шиваются по Гимза в синий цвет.

- Полностью сформировавшиеся зрелые внутриклеточные включения окрашиваются краской Гимза в пурпурный цвет (рис.21).

Метод Грама

Техника (см. выше).

Микроскопическая картина. Окраска по Граму дает вариа­бельные результаты. Поэтому не имеет диагностического значения.

Окраска водным разбавленным раствором Люголя

Придает внутриклеточным формам хламидий коричневый цвет из-за гликогеноподобной оболочки частиц.

Окраска микоплазм

Метод Романовского-Гимза

Техника (см. выше).

Микроскопическая картина. Исследование нативных препа­ратов не дает результата. Окрашивают препарат из куль­туры после агаровой фиксации: кусочек среды с колонией по­мещают на предметное стекло и накрывают покровным стеклом с каплей спиртового раствора метиленового синего и азура, за­тем препарат высушивают.

Окраска спирохет

Методы окраски спирохет делятся на две группы: методы позитивной окраски, когда окрашивается сама клетка, и методы негативной окраски, когда окрашивается фон препарата, а спирохета остается бесцветной.

Из методов позитивной окраски наиболее употребителен метод Романовского-Гимза.

Метод Романовского-Гимза

Техника. См. выше. Особенностью техники окрашивания препаратов спирохет является длительность окраски – в течение 12-15 часов.

Микроскопическая картина. Трепонемы окрашиваются в бледно-розовый, лептоспиры – розово-красный, а боррелии – сине-фиолетовый цвет.

Ускоренная модификация Шерешевского

Техника. 15-20 капель красителя Романовского-Гимза разводят в 10 мл 0,5-1% раствора глицерина в воде, разливают в 4-5 пробирок, каждую из которых последовательно нагревают на пламени горелки. Горячий раствор красителя наливают на препарат на 2 минуты, после чего краситель сливают и препарат заливают свежей порцией горячего раствора из следующей пробирки. Вся окраска занимает 8-10 минут.

Микроскопическая картина. См. метод Романовского-Гимза.

Окраска разведенным фуксином

Используется для окраски боррелий.

Техника.

Реактив: фуксин Циля разводят 1:4 или 1:5. Краситель наносят на фиксированный мазок на 1-2 минуты.

Микроскопическая картина. В мазках крови боррелии окрашиваются в розово- красный цвет, эритроциты – в ярко-красный.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Page 11

Окраску применяют для выявления зернистой формы ту­беркулезных микобактерий (зерен Муха).

Техника. В смеси 10 мл насыщенного спиртового раствора метилового фиолетового и 100 мл 2% водного раствора карболовой кислоты препарат выдерживают сутки. Затем его 1-2 мин обрабатывают раствором Люголя, 1 мин – 5% раствором азотной кислоты и 10 с – 3% раствором хлористоводородной ки­слоты. После дифференцирования в смеси, состоящей из равных объемов спирта и ацетона, до прекращения отхождения краски промывают водой, докрашивают фуксином Пфейффера, вновь про­мывают водой и высушивают.

Микроскопическая картина. Микобактерии окрашиваются в фиолетовый цвет.

Метод Козлова

Метод применяют для выявления зернистой формы ту­беркулезных микобактерий.

Техника. Красят 45 мин в смеси: 1 г генциано­вого фиолетового, 6 г карболовой кислоты, 40 мл глицерина и 100 мл дистиллированной воды. Генциановый фиолетовый и кар­боловую кислоту предварительно растирают в ступке, после чего прибавляют глицерин и дистиллированную воду. Перед употреблением краску разводят 3 частями дистиллированной воды и фильтруют. После промывания препарата водой его 20 секунд обрабатывают раствором Люголя, промывают водой, 2-3 с окра­шивают 0,1% раствором сафранина, вновь промывают водой и су­шат.

Микроскопическая картина. Кислотоустойчивые бактерии окрашиваются в фиолетовый цвет.

Выявление клеточной стенки бактерий

При обычных методах окраски мазков клеточная стенка не окрашивается, поэтому применяют специальные методы с про­травами.

Метод Пешкова

Техника. Препарат фиксируют 15 мин в жидкости следующего состава: 90% спирта 60 мл, хлороформа 30 мл и уксусной эссенции 10 мл. Протравливают 2-5 мин в 10% водном растворе танина. За­тем препарат промывают водой, красят 30-60 с фуксином Пфейф­фера и, не промывая, сушат и микроскопируют.

Микроскопическая картина. Клеточная стенка окрашивается в розово-красный цвет.

Метод Гутштейна

Техника. Препарат, 1-2 ч фиксированный в жидкости Буэна, 2-3 мин подвергают действию протравы (5-10% водный раствор танина), ополаскивают водой и микроскопируют в капле 0,01% водного раствора кристаллического фиолетового.

Микроскопическая картина. Клеточная стенка приобретает фиолетовый цвет.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Page 12

Техника. Препарат, фиксированный жаром, обрабатывают 3-5 мин протравой, состоящей из 70 мл насыщенного водного раствора калийных квасцов и 30 мл 20% водного раствора танина. На мазок, промытый водой, наносят каплю карболового фуксина, закрывают покровным стеклом и микроскопируют, не удаляя краску.

Микроскопическая картина. Клеточная стенка окрашивается в красно-фиолетовый цвет.

Обнаружение нуклеоида бактерий

Окраска ядерных элементов. Метод Романовского

Техника. Препарат фиксируют метиловым спиртом, спирт-формолом, жидкостью Кар­нуа или смесью Никифорова. Окрашивают рабочим раствором кра­сителя (2 капли красителя Гимза на 1 мл дистиллированной воды) 10-20 мин. Промывают дистиллированной водой и после просушивания микроскопируют. Дистиллированная вода, применяемая для разведения красителя, должна иметь нейтральное значение рН, так как от этого в высокой степени зависят результаты окрашивания. Реакция дистиллированной воды, кроме обычно применяемых с этой целью способов, может быть проверена путем прибавления к ней кристаллика гематок­силина или нескольких капель его спиртового раствора. Вода пригодна, если в течение 2 мин не появляется розовая окра­ска; в противном случае она кислая и должна быть подщелочена 1 % раствором бикарбоната натрия.

Микроскопическая картина. При микроскопировании ядерные элементы имеют красно-фиолетовый цвет, цитоплазма – слабо-розовый.

Метод Пикарского

Техника. Препарат обрабатывают I N рас­твором НС1 7 мин при подогревании до 60°С. После про­мывания мазок окрашивают по Романовскому.

Микроскопическая картина. Ядерные эле­менты темно-красные, цитоплазма розовая.

Окраска риккетсий

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Page 13

Техника. К 2 мл этилового спирта добавляют 0,2 г то­луидинового синего, а затем 100 мл 5% раствора уксусной ки­слоты (5 мл ледяной уксусной кислоты + 95 мл воды). На фик­сированный мазок наливают краску и нагревают 1-2 минуты, до появления паров. Дают остыть, смывают водой и высушивают.

Микроскопическая картина: тела палочек – синего цвета, метахроматические зерна – красновато-фиолетовые.

Окраска по Мейеру

Техника. Одновременно из исследуемых бактерий готовят два одинаковых препарата и фиксируют жаром или в те­чение 5-15 мин в жидкости Карнуа. Красят оба мазка 10 мин метиленовым синим Леффлера и затем один из них помещают в 1% водный раствор серной кислоты, другой – в 4% водный раствор карбоната калия. Через 5 мин препараты сушат фильтровальной бумагой (не промывать). Препарат, обработанный кислотой, до­крашивают 0,25% раствором светлого зеленого (лихтгрюн) с 2-3 каплями крепкой уксусной кислоты или хризоидином.

Микроскопическая картина. Бактерии окрашиваются в зеленый или коричневый цвет, зерна волютина – в вишнево-красный. В препарате, обработанном щелочью, волю­тин обесцвечен – пустоты на фоне слабо окрашенных бактерий.

Флуорохромирование волю­тина корифосфином

Техника. 2 мл основного раствора корифосфина 1:1000 на дистиллированной воде, 6 мл уксусной кислоты, до 50 мл дистиллированной воды. Препарат фиксируют метиловым спиртом 8 с, промывают водой, высушивают. На 10 мин наливают рабочий раствор корифосфина, сливают, вновь промывают водой и высушивают на воздухе.

Микроскопическая картина. Бактерии желто-зеленые, зерна волютина оран­жево-красные.

Окраска по Раскиной

Техника. На препарат наливают краситель, со­стоящий из карболового фуксина Циля – 4 мл, насыщенного рас­твора метиленового синего – 4 мл, ледяной уксусной кислоты – 5 мл, 95% спирта – 95 мл, дистиллированной воды – до 200 мл. Препарат подогревают на пламени до сгорания спирта, а затем промывают водой и высушивают.

Микроскопическая картина. Бактерии окрашиваются в светло-красный цвет, зерна волютина – в черно-синий.

Окраска на грамофильную зернистость

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Page 14

Техника. Метод Петрука – модификация метода Грея. Вме­сто карболового фуксина применяют нитрат серебра, раствор которого готовят следующим образом: 1 г АgNОз растворяют в 2 мл дистиллированной воды, к нему по каплям добавляют 5% рас­твор аммиака до растворения образовавшегося осадка и появле­ния легкой опалесценции. Этот исходный раствор разбавляют в 10 раз дистиллированной водой и применяют для окраски. Пре­парат с нанесенным на него раствором нитрата серебра слегка подогревают над пламенем.

Микроскопическая картина. Жгутики окрашиваются в желто-коричневый цвет.

Окраска включений в бактериях

Окраска метахроматических зерен (волютина)

Волютин является запасным полифосфатом у некоторых видов бактерий, Его наличие и расположение в клетке может иметь диагностический характер, например, у коринебактерий дифтерии (тельца Бабеша-Эрнста).

Метод Нейссера

Способ 1.

Приготовление краски Нейссера: а) метиленового синего 0,1 г, 95% спирта 2 мл, ледяной уксусной кислоты 5 мл, дистиллированной воды 100 мл; б) раствор хризоидина, или везувина, или бисмаркабраун красителя 1 г, дистиллированной воды 300 мл. Краситель растворяют в кипящей воде и фильтруют через бу­магу.

Техника. Препараты выдерживают по 1 минуте в растворе метиленового синего и в растворе Люголя. Промывают водой. Докрашивают раствором хризоидина (или везувина, или бисмаркбраун) 1-3 мин. Промывают водой.

Микроскопическая картина. Тела бактерий окрашиваются в светло-желтый цвет, зерна Бабеша-Эрнста – в темно-синий.

Способ 2.

Приготовление растворов. Готовят ос­новные растворы:

Раствор 1:

- Метиленового синего – 0,1 г

- Этилового спирта 95° – 2 мл

- Ледяной уксусной кислоты – 5 мл

- Дистиллированной воды – 100 мл

Раствор 2:

- Кристаллвиолета – 1 г

- Этилового спирта 95° – 10 мл

- Дистиллированной воды – 300 мл

Для окраски смешивают две части раствора 1 с одной ча­стью раствора 2.

Техника окраски. На фиксированный мазок наливают смесь растворов 1 и 2, через минуту краску сливают и мазок обрабатывают раствором Люголя в течение минуты, затем про­мывают водой, докрашивают в течение 2-3 минут раствором хризоидина (1 г краски в 300 мл дистиллированной горячей воды), промывают водой и высушивают.

Микроскопическая картина. Тела бактерий окрашиваются в светло-желтый цвет, зерна волютина (Бабеша-Эрнста) – в темно-синий (рис.19).

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Page 15

Техника. На нефиксированный мазок наливают 0,5% рас­твор хлористоводородной кислоты и подогревают 1-2 мин. С препарата сливают кислоту, промывают его водой и после высы­хания фиксируют на пламени. Фиксированный препарат красят по способу Циля-Нильсена.

Микроскопическая картина. Тела бактерий окрашиваются в синий цвет, споры – в красный (рис.16).

Метод Виртца в модификации Саватеева

Приготовление растворов. К насыщенному водному рас­твору (около 5%) малахитового зеленого добавляют 5% глице­рина, пропитывают смесью полоски фильтровальной бумаги и вы­сушивают их (лучше при 50°С). Затем готовят 0,5% водный рас­твор сафранина, которым смачивают другие полоски фильтро­вальной бумаги и высушивают.

Техника. На фиксированный над пламенем мазок наносят 2-3 капли дистиллированной воды и накладывают по­лоску фильтровальной бумаги, окрашенной малахитовым зеленым. Препарат нагревают над пламенем горелки до появления паров (3-4 раза), приблизительно в течение минуты. При испарении воды ее добавляют. После остывания препарата краску с бумаж­кой смывают струей воды (полминуты) и сейчас же на мокрую поверхность препараты кладут бумажку, окрашенную сафранином. Через 30-40 секунд мазок промывают водой, высушивают и микроскопируют.

Микроскопическая картина. Свободно лежащие споры – зе­леновато-голубого цвета, споры внутри микробных клеток – темно-зеленые, вегетативные формы микробов – красные.

Модификация Шеффлера и Фултона

Техника. На препарат, фиксированный жаром, наносят на 30-60 секунд 5% водный раствор малахитового зеленого и нагревают до появле­ния паров 3-4 раза. Мазок промывают и докрашивают 0,5% водным раствором сафранина в течение 30 секунд. Промывают водой, высушивают через фильтровальную бу­магу.

Микроскопическая картина. Споры зеленые, а вегетативные клетки красные.

Окраска по Биттеру

Техника. Нефиксированный мазок, обработан­ный 10% раствором формалина (10 мин), промытый водой и вы­сушенный, красят аммиачным метиленовым синим (20 мл насы­щенного спиртового раствора метиленового синего, 3 мл креп­кого раствора Nh50H и 80 мл дистиллированной воды) 3 минуты, нагревая стекло до закипания жидкости. После промывания во­дой и высушивания докрашивают мазок везувином или сафрани­ном 3-5 мин. Вновь промывают, высушивают и микроскопируют.

Микроскопическая картина. В мазке бактерийные тела красные или буро-желтые (в зависимости от краски, примененной для докрашивания), споры синие.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Page 16

Окраска капсул микробов может иногда иметь диагностиче­ское значение. Бактериальные капсулы представляют собой слизистый слой, состоящий из разбухших в воде в виде геля полисахаридов или полипептидов.

В мазках из органов или из тканей капсулы можно обнаружить при помощи простой окраски щелочным или другими растворами метиленового синего. Однако специальные окраски дают более четкие препараты.

Для их выявления в мазке можно использовать негативные методы окраски, при которых окрашивают фон препарата и клетки, окруженные бесцветными капсулами.

Метод Бурри-Гинса

Техника. На середину предметного стекла наносят капельку туши и смешивают ее петлей с каплей культуры. Делают мазок ребром покровного стекла, дают высохнуть и микроскопируют. На чер­ном фоне видны неокрашенные микробы, капсулы.

Мазок, окрашенный тушью по Бурри, фиксируют сулемой, ме­тиловым спиртом или на пламени. После промывания водой кра­сят 5-10 мин карболовым раствором тионина или фуксина и вновь промывают, а затем высушивают.

Микроскопическая картина. Бактерии фиолетовые или крас­ные. Фон черный. Капсулы неокрашенные (рис.17).

Способ Михина

Техника. Фиксированный мазок окрашивают метиленовым синим Леффлера в течение 2-3 минут при подогревании (до появления паров). Затем краску быстро смывают водой и мазок высушивают фильтровальной бумагой.

Микроскопическая картина. Капсулы – светло-розовые, бактерии – темно-синие.

Способ Ольта

Техника. Мазок окрашивают 2-3 % водным раствором сафранина в течение 1-3 минут с последующим быстрым смыва­нием водой. Раствор сафранина готовят перед употреблением, растворяя краску в горячей воде с последующим фильтрованием. На мазок наносят каплю воды, накрывают покровным стеклом, а на него помещают каплю иммерсионной жидкости.

Микроскопическая картина: капсулы – бледно-желтого, а бактерии – коричневого цвета.

Способ Кауфмана

Техника. Мазок окрашивают метиленовым синим Леффлера в течение 2-3 минут. Краску смывают водой и мазок погру­жают в 0,25% водный раствор протаргола или 0,5% раствор азотнокислого серебра на 3-4 минуты, затем окрашивают кар­боловым раствором фуксина, разведенным 1:20, в течение 5-10 секунд, промывают водой и высушивают.

Микроскопическая картина: капсулы – темно-красные, бак­терии – темно-синие.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Page 17

Техника. Препарат фиксируют формалином, причем фикса­ция происходит одновременно с окраской. Для этого гото­вят раствор: 15-20 г генцианвиолета растворяют в 100 мл 40% формалина; дают раствору постоять несколько часов и фильт­руют. Окрашивают нефиксированный мазок указанным раствором в течение 15-20 секунд, быстро промывают водой и высушивают.

Микроскопическая картина: капсулы – красновато-фио­летовые, бактерии – темно-фиолетовые.

Способ Ионе

Техника. Фиксированный мазок окрашивают 2% водным рас­твором метилвиолета (или генцианвиолета) в течение 1-2 минут при подогревании. Краску быстро смывают небольшим ко­личеством воды, мазок в течение 10 секунд обрабатывают 2% раствором уксусной кислоты, промывают водой и высушивают.

Микроскопическая картина: капсулы – розовато-фиолето­вые, бактерии – темно-фиолетовые.

Окраска по Антони

Техника. Мазок красят (без фиксации!) на хо­лоду 1% водным раствором кристаллического фиолетового 2 мин. Затем промывают 20% водным раствором серной кислоты и высу­шивают фильтровальной бумагой.

Микроскопическая картина. Бактерии окрашиваются в темно-синий цвет, капсулы – в сине-фиолетовый.

Окраска по Гиссу

Техника. Препарат, фиксированный любым спосо­бом, кроме жара, красят 5% водным раствором генцианового фиолетового, подогревая до появления паров. Мазок промывают 20% водным раствором медного купороса и сушат.

Микроскопическая картина. Бактерии и капсулы окрашиваются в фиолетовый цвет различной интенсивности.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Page 18

Это одна из наиболее трудных процедур в бактериологиче­ской технике, так как жгутики очень легко повреждаются при приготовлении препарата. Поэтому здесь требуется особая тща­тельность работы. Стекла для препаратов должны быть абсо­лютно чисты и обезжирены. Обычно работают с новыми покров­ными стеклами, которые предварительно кипятят в течение 10 мин в хромовой смеси (двухромовокислого калия 20 г, воды 200 мл, серной кислоты 20 мл; приливать в указанном порядке). После кипячения стекол хромовую смесь сливают, промывают стекла 5 мин в слабом растворе едкого натра, после чего обильно промывают водой, ополаскивают спиртом и хранят в спирте (во время промывания не касаться стекол руками). Пе­ред употреблением стекла вынимают из спирта чистым пинцетом и удаляют спирт обжиганием (ничем не вытирать!).

Исследуемая культура должна быть не старше 12-18 ч. Ма­териал берут осторожным прикосновением петли к культуре и вносят в пробирку с несколькими миллилитрами водопроводной воды, погружая петлю в воду и держа ее неподвижно некоторое время. Повторяют это 2-3 раза, пока не получится тонкая, лишь слегка опалесцирующая взвесь. Полученной взвеси дают постоять 15-20 мин в термостате для равномерного распределе­ния микробов в воде. Затем платиновой петлей переносят каплю на покровное стекло. Если стекло достаточно чисто, капля принимает правильную круглую форму, легко расплывается и бы­стро высыхает на воздухе без подогревания. Препараты фикси­руют на огне и окрашивают специальными способами, причем пе­ред окраской обрабатывают протравой, которая усиливает дей­ствие краски.

Метод Леффлера

Техника. За 1-2 суток до употребления готовят про­траву, состоящую из 1 мл насыщенного спиртового раствора ос­новного фуксина, 10 мл 20% водного раствора танина, 5,5 мл насыщенного на холоду водного раствора сульфата закисного аммиачного железа (соль Мора). Перед употреблением фильт­руют. Препарат, приготовленный на покровном стекле, фикси­руют и помещают на часовое стекло. Наливают протраву и 30-50 с подогревают до отхождения паров. Дав стеклу остыть, его промывают водой и, поместив на другое часовое стекло, красят фуксином Циля 2-3 мин при слабом подогревании. После тща­тельной промывки и высушивания препарат готов для микроско­пирования.

Микроскопическая картина. Жгутики окрашиваются в розово-красный цвет (рис.18).

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Page 19

Готовят 3 реактива: 1)1 мл ледяной ук­сусной кислоты, 2 мл имеющегося в продаже формалина, 100 мл дистиллированной воды; 2)5 г танина, 1 мл жидкой карбо­ловой кислоты, 100 мл дистиллированной воды; 3)5 г кристаллического нитрата серебра растворяют в 100 мл дистиллированной воды, отливают 20 мл в другой со­суд, к оставшимся 80 мл раствора по каплям добавляют рас­твор аммиака, пока не растворится образующийся осадок и не останется легкая опалесценция; если аммиака будет добавлено слишком много, то из отлитых в другой сосуд 20 мл раствора серебра надо добавлять по каплям до получения нужной слабой опалесценции. Для окраски препарата раствор серебра разво­дят дистиллированной водой 1:10.

Техника. Наливают на 1 мин первый реактив, сливают, промывают препарат водой, наливают второй реактив, подогревают на легком пламени до отхождения паров (1 мин), тщательно промывают водой, 1-2 мин при подогревании обраба­тывают препарат третьим реактивом до появления темно-корич­невой окраски мазка, тщательно промывают водой, высушивают. Рассматривают с иммерсионной системой.

Микроскопическая картина. Жгутики окрашиваются в буро-черный цвет.

Метод Грея

Растворы, составляющие протраву, смешивают за сутки до употребления. Растворы состоят из: 1) насыщен­ного водного раствора калийных квасцов K2SO4×12Н2О – 5 мл, 20% водного раствора танина – 2 мл и насыщенного водного раствора двухлористой ртути – 2 мл; 2) насыщенного спиртового раствора основного фуксина – 0,4 мл.

Техника. Протраву наливают на препарат на 8-10 мин, затем промы­вают его дистиллированной водой и окрашивают 5 мин карболо­вым фуксином Циля. Вновь промывают водой, сушат на воздухе и микроскопируют.

Микроскопическая картина. Жгутики окрашиваются в крас­ный цвет.

Окраска по Шенку

Протраву, состоящую из двух растворов, гото­вят за 7-10 дней до употребления. Первый раствор состоит из 30 мл насыщенного водного раствора танина и 10 мл 5% вод­ного раствора полуторахлористого железа, второй – из 1 мл анилина и 4 мл 95% спирта.

Техника. На препарат наносят 8 капель первого и 1 каплю второго раствора. После того как избыток протравы сливают, на п­репарат наносят краску (без промывания). Красить можно 1% сафранином в 50% спирте или метиленовым синим Леффлера. Хо­рошие результаты можно получить, применив для окраски смесь 30 мл метиленового синего Леффлера и 8 мл второго раствора протравы.

Микроскопическая картина. Жгутики приобретают синий цвет.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Page 20

Техника. Фиксированный препарат окрашивают смесью аурамина 00 (0,12 г), карболовой кислоты (5 мл), дистиллированной воды (до 100 мл). Краситель нали­вают на мазок, подогревают на пламени до появления паров. Через 10 мин препарат промывают водой и обесцвечивают 15 с солянокислым спиртом. Препарат промывают и подсушивают на воздухе.

Микроскопическая картина. Туберкулезные микобактерии флуоресцируют золотисто-желтым цветом.

Окраска акридиновым оранжевым

Техника. Мазки, фиксированные 3-5 мин метиловым спиртом, погружают в раствор (1:10000) краси­теля, к 10 мл которого добавлено 3-5 капель 10% раствора ам­миака. Через 24 ч препарат обесцвечивают 3% солянокислым спиртом (дважды по 10 с), промывают и высушивают.

Микроскопическая картина. Туберкулезные микобактерии флуоресцируют желто-оранжевым цветом.

Флуорохромирование акридиновым желтым

Техника. Мазок на 30 с помещают в водный раствор (1:5000) флуорохрома, затем про­мывают. Дифференцируют солянокислым спиртом 15 с, вновь про­мывают и высушивают.

Микроскопическая картина. Туберкулезные микобактерии флуоресцируют желтым цветом.

Окраска спор

Бактериальные споры, отличающиеся от вегетативных клеток многослойной липидосодержащей оболочкой, пропитанной депиколатом кальция, не поддаются окраске простыми методами и по Граму. Для окраски спор разработаны специальные методы, направленные на увеличение их проницаемости с использованием растворов кислот, концентрированных красителей и подогрева.

Способ Пешкова

Техника. На мазок, фиксированный жаром (над пламе­нем!), наливают синий Леффлера и подогревают стекло до заки­пания краски. Дают 15-20 с покипеть, а затем (после того как стекло остынет!) промывают водой и докрашивают препарат 30 с 0,5% водным раствором нейтрального красного. Вновь промы­вают, сушат и микроскопируют.

Микроскопическая картина. Споры окрашиваются в голу­бой цвет, клетки – в розовый.

Способ Ганзена

Техника. Препарат, приготовленный обычным способом, при нагревании окрашивают 1-2 мин карболовым фуксином Циля, промывают водой и обесцвечивают, погружая стекло в 2% рас­твор азотной кислоты в спирте или в 1 % водный раствор сер­ной кислоты. Обесцвечивать надо так, чтобы на препарате не было видно следов красителя. Затем промывают водой и докра­шивают водным раствором метиленового синего.

Микроскопическая картина. Споры окрашиваются в крас­ный цвет.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Page 21

Красители, применяемые для бактериологических исследова­ний, относятся к группе так называемых анилиновых. Они раз­деляются на «основные» и «кислые». Термины «кислые» и «ос­новные» только определяют сродство краски к определенной части клетки. Основными красками хорошо окрашиваются ядерный хроматин и микробы. Кислые краски окрашивают микробов сла­бее, при окраске же тканей они окрашивают протоплазму кле­ток. Наиболее употребительны следующие краски: метиленовый синий, тионин (синие краски), основной фуксин, сафранин и эозин (красные), бисмарк-браун, или везувин (коричневая), метилгрюн (зеленая), метилвиолет, генцианвиолет, кристаллвио­лет (фиолетовые). Из них только эозин – кислая краска; она употребляется для некоторых специальных целей. Все эти краски продаются в виде аморфных или кристаллических порош­ков, из которых готовят красящие растворы.

Приготовление красящих растворов. Исходным материалом почти для всех необходимых рабочих красок являются насыщен­ные спиртовые растворы, которые следует иметь в запасе и со­хранять в склянках с притертыми пробками. Насыщенные спирто­вые растворы готовят следующим образом: 10 г сухой краски насыпают во флакон с притертой пробкой, наливают 100 мл 96º спирта (ректификата) и дают настояться в течение нескольких дней, каждый день, взбалтывая раствор. Из таких насыщенных растворов готовят спиртово-водные растворы, пригодные для окраски микробов. Наиболее часто употребляются следующие растворы:

Карболовый фуксин (фуксин Циля)

10 мл насыщенного спиртового раствора фуксина

90 мл 5% карболовой кислоты

Разведенный фуксин

10 мл карболового фуксина

90 мл дистиллированной воды

Щелочной метиленовый синий

30 мл насыщенного спиртового раствора метиленового синего

100 мл дистиллированной воды

1мл 1% раствора щелочи

Карболовый генцианвиолет

10 мл насыщенного спиртового раствора генцианвиолета

90 мг 5% карболовой кислоты.

Растворы генцианвиолета дают осадок при окрашивании. Вместо генцианвиолета можно пользоваться насыщенными спирто­выми растворами метиленвиолета или кристаллвиолета. Растворы карболовой кислоты можно брать 1%, а не 5%. Кроме того, для окраски по Граму можно пользоваться 0,25% водным раствором метиленвиолета или кристаллвиолета без карболовой кислоты. Раствор стоек и осадка не дает.

По методу Синева вместо раствора генцианвиолета приме­няют кусочки фильтровальной бумаги, предварительно пропитан­ной спиртовым раствором краски и затем высушенные. Для этого листы фильтровальной бумаги погружают на 1-2 минуты в 1-2% раствор краски в 96º спирте, бумагу высушивают и разрезают на кусочки величиной 2´4 см. Такие бу­мажки сохраняются в банках с притертой пробкой неограничен­ное время.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Page 22

ПРИЖИЗНЕННАЯ (ВИТАЛЬНАЯ) ОКРАСКА МИКРООРГАНИЗМОВ

Окрашивание живых микроорганизмов позволяет изучить характер и степень их подвижности. Применение этих методов ограничивается слабой восприимчивостью живых клеток к анилиновым красителям и нестойкой окраской препаратов. Следует также учесть, что при таких методах окра­ски микробы сохраняют жизнеспособность, и препараты могут яв­ляться инфекционным материалом.

Окраска метиленовым синим

Техника. Чистое предметное стекло смачивают кипящим насыщенным водным раствором метиленового синего. Когда краска на стекле высохнет, его протирают сухой тряпочкой до нежно-голубой окраски. На подготовленное таким образом стекло наносят каплю исследуемой культуры, покрывают покров­ным стеклом и микроскопируют.

Микроскопическая картина. Микробы постепенно окрашива­ются в бледно-голубоватый цвет.

Окраска нейтральным красным

Приготовление красителя: насыщенный на хо­лоду водный раствор нейтральрота разводят физиологическим раствором хлористого натрия 1:100.

Техника. Каплю исследуемого материала смешивают на предметном стекле с каплей разведенного нейтральрота. Препарат покрывают по­кровным стеклом и микроскопируют с иммерсией.

Микроскопическая картина. Микробы постепенно окрашива­ются в розоватый цвет.

Негативный способ окраски живых бактерий

Для окраски используют тушь, негрозин, конго крас­ный. Тушь чертежную разводят дистиллированной водой в соот­ношении 1:10. Конго красный используют в виде 3% водного раствора.

Метод Бурри

Техника. Каплю исследуемой культуры смешивают на пред­метном стекле с каплей туши, затем с помощью другого стекла, поставленного к первому под углом в 45°, делают тон­кий мазок по принципу приготовления мазков из крови. Мазок высушивают на воздухе и микроскопируют нефиксированным.

При использовании раствора конго рот после высушива­ния мазок обрабатывают 1% раствором соляной кислоты в аб­солютном алкоголе, затем высушивают и микроскопируют.

Микроскопическая картина: на окрашенном фоне ясно видны неокрашенные светлые микробные клетки.

ОКРАСКА ФИКСИРОВАННЫХ ПРЕПАРАТОВ МИКРООРГАНИЗМОВ

В микробиологической работе наиболее употребительны способы окраски фиксированных микроскопических препаратов, кото­рые в основном можно разделить на две группы: ориентировоч­ные, или простые, и дифференциальные, выявляющие химические и структурные особенности того или иного вида микроорганизма.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Page 23

Простые методы окраски препаратов предполагают использование одного анилинового красителя и позволяют изучить такие морфологические признаки микроорганизма, как форму, размеры, расположение в мазке. Для этих целей используется ряд красителей: метилено­вый синий, фуксин и др.

Окраска спиртово-водным раствором метиленового синего

Приготовление раствора: красителя 1 г, 95% спирта 10 мл, дистиллированной воды 100 мл.

Техника. Нанести на фиксированный мазок на 3-5 минут.

Микроскопическая картина. Все клетки окрашиваются в синий цвет.

Окраска водным раствором метиленового синего

Приготовление раствора: красителя 1 г, дистиллированной воды 1000 мл.

Техника. Нанести на фиксированный мазок на 5-10 минут.

Микроскопическая картина. Окраска дает нежные отчетливые препа­раты клеток, окрашенных в синий цвет.

Окраска щелочным метиленовым синим (синим Леф­флера)

Приготовление щелочного раствора метиленового синего: дистиллированной воды 100 мл, 10% раствора едкого калия 2 капли, насыщенного (7%) раствора метиленового синего 30 мл или 2) метиленового синего 3 г, 95% спирта 20 мл, 1 % раствора едкого калия 1 мл, дистилли­рованной воды 100 мл. Это стойкий и хорошо красящий раствор.

Техника. Нанести на фиксированный мазок на 3-10 минут.

Микроскопическая картина. Дает окраску в синий цвет различной интенсивности для разных видов микроорганизмов и тканевых элементов (рис.13).

Окраска разведенным карболовым фук­сином

Техника. На зафиксированный мазок наносят фуксин Циля, разведенный непосредственно перед окраской, дистилли­рованной водой в соотношении 1:10. Выдерживают 1-2 минуты, после чего смывают водопроводной водой, высушивают и микро­скопируют.

Микроскопическая картина. Все клетки равномерно окра­шиваются в розово-красный цвет.

Приготовление и окраска препаратов для люминесцентной микроскопии

Препараты для люминесцентной микроскопии готовят так же, как для световой. Это относится и к их фик­сации. Окраска препаратов отличается тем, что для люми­несцентной микроскопии применяют специальные красители – флуорохромы. Их отличительная особенность – способность све­титься под воздействием ультрафиолетовых и сине-фиолетовых лучей. Среди флуорохромов встречаются самые разнообразные органические вещества. Для окраски микроскопических препаратов применяют очень слабо концентрированные (1:500-1:100000) растворы флуорохромов. Растворы готовят на дистиллированной воде, изотоническом растворе хлорида натрия или буферных смесях и хранят в тем­ной склянке, избегая действия света.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Page 24

Дифференциально-диагностический метод окраски по Граму

Наиболее употребительной среди дифференциальных методов является окраска по Граму. При этом методе выявляется спо­собность бактерий удерживать краситель (грамположительные бактерии) или обесцвечиваться в спирте (грамотрицательные бактерии), что связано с различиями в химическом составе и структуре их клеточных стенок.

Для выполнения окраски по Граму надо приготовить следующие растворы.

Карболовый раствор генцианового фиолетового или кристал­лического фиолетового: 1) красителя 1 г, 96% спирта 10 мл, кристаллической карболовой кислоты 2 г, дистиллированной воды 100 мл (растирают в ступке краситель с карболовой ки­слотой до консистенции кашицы, прибавляют небольшими пор­циями спирт и окончательно разводят водой, сливают в бутыль, оставляют на сутки, затем фильтруют) или 2) насыщенного (4,8%) спиртового раствора красителя 10 мл, 2% карболовой воду 100 мл.

Фуксин Пфейффера. См. разведенный фуксин.

Раствор Люголя (в модификации Грама): йодида калия 2 г, дистиллированной воды 10 мл, йода кристаллического 1 г. Смесь хорошо укупоривают, оставляют на сутки, после чего до­бавляют дистиллированной воды 300 мл.

Техника. На фиксированный мазок накладывают кусочек фильтроваль­ной бумаги, и на нее наливают карболовый раствор генцианового фиолетового на 0,5-1 мин. Сливают краситель и, не смывая, на­ливают раствор Люголя на 1 мин. Сливают раствор Люголя и прополаскивают препарат в 95% спирте в течение 0,5-1 мин, пока не перестанет отходить краситель. Промывают водой. До­полнительно окрашивают разведенным фуксином в течение 0,5-1 мин. Краситель сливают, препарат промывают и высушивают.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Page 25

Заготовляют полоски фильтровальной бумаги, пропитанной 1% спиртовым рас­твором кристаллического фиолетового и высушенной.

Техника.

1. На фиксированный мазок наносят полоску фильтровальной бумаги, приготовленной по методу Синева, и несколько капель воды на 1-2 минуты.

2. Затем снимают пинцетом бумагу. Не промывая препарат водой, сливают краску и наносят раствор Люголя на минуту до полного почернения.

3. Сливают раствор Люголя, не промывая водой, погружают препарат в стаканчик с 96° спиртом на 20-30 секунд до отхож­дения фиолетовых струй краски.

4. Препарат тщательно промывают водой для удаления спирта.

5. Докрашивают фуксином Пфейффера в течение 3 минут. Краску смывают водой, препарат высушивают и микроскопируют.

Микроскопическая картина. Грамположительные бактерии окрашиваются в фиолетовый цвет, грамотрицательные – в розово-красный (рис.14).

Окраска кислото- и спиртоустойчивых микробов

В связи с высоким содержанием липидов эта группа бактерий плохо прокрашивается обычными растворами анилиновых красителей, поэтому для их окраски используют либо концентрированные красители при условии прогревания мазка, либо флуорохромы. В последнем случае для изучения препарата используют люминесцентную микроскопию.

Окраска по Цилю-Нильсену

Наиболее употребительный метод окраски микобактерий ту­беркулеза. Для увеличения степени проницаемости бактериальной клетки препарат окрашивают фуксином Циля при подогревании. Окрашенные кислотоустойчивые микроорганизмы затем не обес­цвечиваются слабыми растворами минеральных кислот и спир­тами.

Техника.

1. Фиксированный мазок покрывают фильтроваль­ной бумагой и наливают фуксин Циля. Затем, удер­живая препарат пинцетом, подогревают его в пламени горелки до отхождения паров. Повторяют манипуляцию 2-3 раза, добав­ляя по мере необходимости краску. После охлаждения снимают бумагу и промывают водой.

2. Препарат обесцвечивают 5% раствором серной кислоты, затем тщательно промывают водой.

3. Окрашивают водно-спиртовым раствором метиленового си­него в течение 3-5 минут, промывают водой, высушивают и микроскопируют. Мазок, окра­шенный по Цилю-Нильсену, вместо докраски метиленовым синим можно протравливать насыщенным раствором пикриновой кислоты (по Шпенглеру).

Микроскопическая картина. Кислотоустойчивые бактерии окрашиваются в розово-красный цвет, другие формы приобре­тают синюю окраску (рис.15).

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Page 26

Материал забирают стерильной пипеткой или петлей и нанося на середину предметного стекла. Затем вторым предметным стеклом покрывают первое так, чтобы остались свободными треть первого и второго стекол. Стекла раздвигают в стороны и получают два отдельных больших мазка.

Приготовление мазков из крови

Каплю крови наносят на границу между левой и средней третью предметного стекла. Затем краем второго специально отшлифованного стекла прикасаются к капле крови, располагая стекло под углом в 45°. Прижимая отшлифованное стекло к предметному, продвигают его. Хорошо сделанный мазок имеет желтоватый цвет и просвечивает.

Приготовление мазков-отпечатков из внутренних органов трупов и пищевых продуктов твердой консистенции

Раскаленным скальпелем прижигают поверхность органа или пищевого продукта и из этого участка вырезают кусочек материала. Разрезанной поверхностью прикасаются к стеклу в 2-3 местах.

Фиксация мазка

После полного высыхания мазки фиксируют, чем достигается умерщв­ление микробов и прочное прикрепление их к стеклу. Фиксация резко улучшает окрашиваемость микро­бов, которые в живом виде слабо воспринимают краски. Самый простой и рас­пространенный способ – фиксация жаром. Держа стекло мазком вверх, его трижды проводят через пламя газовой или спиртовой горелки (мазком вверх). Во избежание перегрева препарата время фиксации не должно превышать 5-6 с, а время прямого воздействия пламени – 2 с. Кроме жара, для фиксации могут быть применены следую­щие вещества:

1. Этиловый 95% спирт. Время фиксации 10-15 мин.

2. Смесь равных объемов абсолютного спирта и эфира (по Никифорову) – 10-15 мин.

3. Метиловый спирт – 5 мин.

4. Ацетон – 5 мин.

5. 1% раствор сулемы – 10-15 мин и затем промывание пре­парата раствором NaCI и водой.

6. 10% раствор AgNO3 – 10 мин.

7. Жидкость Буэна: формалина неразбавленного 10 мл, ле­дяной уксусной кислоты 2 мл и насыщенного водного раствора пикриновой кислоты 30 мл.

8. Жидкость Карнуа: ледяной уксусной кислоты 10 мл, хло­роформа 30 мл и 96% спирта 60 мл.

ОКРАСКА ПРЕПАРАТОВ

Способность микроорганизмов к окрашиванию различными красителями определяет их тинкториальные свойства.

Методы окраски микробов разнообразны и многочисленны. В бактериологической работе наиболее употребительны приводи­мые ниже рецепты красок и способы окраски препаратов, кото­рые в основном можно разделить на две группы: ориентировоч­ные простые окраски и окраски дифференциальные, выявляющие химические и структурные особенности бактерий.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

studopedia.ru


Смотрите также